一种老黄酶NemR-PS突变体及其在制备(S)-香茅醇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种老黄酶NemR

【技术实现步骤摘要】
一种老黄酶NemR
‑
PS突变体及其在制备(S)
‑
香茅醇中的应用
(一)

[0001]本专利技术属于生物催化领域，特别涉及老黄酶NemR
‑
PS突变体及其在多酶级联催化还原(E/Z)
‑
柠檬醛合成(S)
‑
香茅醇中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]香茅醇是一种重要的香精原料，具有一个手性碳原子。自然界中的香茅醇含有两种对映体，(R)
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香茅醇和(S)
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香茅醇。较(R)
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香茅醇而言，(S)
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香茅醇的香气更为幽雅。(S)
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香茅醇也是重要的手性中间体，可合成全顺式的玫瑰醚。(S)
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香茅醇还具有多种生物活性，包括体外的抗细菌和抗真菌作用。
[0003]工业上香茅醇的合成主要以柠檬醛、香叶醇或橙花醇为底物，通过催化剂催化加氢制备香茅醇。化学法加氢选择性低，产生的副产物较多。以(E/Z)
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柠檬醛为底物时，(E)
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柠檬醛和(Z)
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柠檬醛的还原产物往往光学性质是互补的，因而产物的光学纯化不高。与化学法相比，生物法还原柠檬醛生成(S)
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香茅醇，具有优异的化学选择性和对映体选择性。天津大学元英进通过强化代谢途径构建了发酵产香茅醇的重组酿酒酵母，该酵母发酵116h香茅醇产量达到8.30g/L。2021年，Ying等人通过构建老黄酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的多酶级联体系实现了一锅法还原(E/Z)
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柠檬醛生成(S)
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香茅醇。在400mM柠檬醛底物浓度下，催化反应36h时转化率为>99.5％。
[0004]为了提高多酶级联合成(S)
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香茅醇的催化效率，来源于斯氏普罗威登斯菌Providencia stuartii老黄酶NemR
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PS进行了分子改造，获得了活力提高的突变体NemR
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PS
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D275G/F351A。构建共表达老黄酶突变体NemR
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PS
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D275G/F351A、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH
M6
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1
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YsADH
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BmGDH
M6
/pET28a
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NemR
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PS
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D275G/F351A，以该菌为整细胞催化剂，采用恒速流加方式加入底物和辅底物，多酶级联催化还原(E/Z)
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柠檬醛生成(S)
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香茅醇，在12h内可累积500mM的光学纯(S)
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香茅醇。目前，未见对基于NemR
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PS的275位天冬氨酸和351位苯丙氨酸的活力改造报道，也未见利用老黄酶突变体NemR
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PS
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D275G/F351A用于合成(S)
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香茅醇的报道。与专利文献(申请号：2021108203589；一种三酶共表达重组菌及其在(S)
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香茅醇合成中的应用)相比，老黄酶突变体的应用以及底物和辅底物加入方式的改变，产物浓度从400mM提高到了500mM，并且所需的反应时间从36h缩短到了12h，显著地提高了催化效率。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种老黄酶NemR
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PS突变体及其在合成(S)
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香茅醇中的应用，通过对源自斯氏普罗威登斯菌的老黄酶NemR
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PS的分子改造，成功获得了高酶活力且保持严格(S)
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对映体选择性老黄酶NemR
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PS突变体，特别是突变体NemR
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PS
‑
D275G/F351A。同时采用多酶级联催化还原(E/Z)
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柠檬醛合成(S)
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香茅醇，通过共表达老黄酶突变体、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的运用，结合底物和辅底物加入方式的改变，显著提高了多酶级联还原(E/Z)
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柠檬醛合成(S)
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香茅醇的催化效率。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术提供一种老黄酶NemR
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PS突变体，所述老黄酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第275位、第351位氨基酸进行单突变或双突变获得的。
[0008]优选，所述老黄酶NemR
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PS突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第275位天冬氨酸突变替换为甘氨酸，同时第351位苯丙氨酸突变替换为丙氨酸获得的，记为NemR
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PS D275G/F351A。所述老黄酶突变体NemR
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PS D275G/F351A的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
[0009]本专利技术还提供一种所述老黄酶突变体编码基因、编码基因构建的重组载体以及重组载体构建的重组基因工程菌。所述含老黄酶突变体编码基因的重组载体及基因工程菌由如下方法得到：将老黄酶突变体编码基因插入pET28a载体的Nco I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体。以重组载体为模板，利用带有突变碱基的引物经过反向PCR扩增全质粒，得到的PCR产物经DpnⅠ酶消化甲基化，酶切产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可得到含老黄酶突变体基因的基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET28a
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NemR
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PS
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D275G/F351A，其中含重组老黄酶突变体编码基因的质粒命名为pET28a
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NemR
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PS
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D275G/F351A)。
[0010]本专利技术还提供一种老黄酶NemR
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PS突变体在还原(E/Z)
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柠檬醛合成(S)
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香茅醇中的应用，所述应用为：以共表达老黄酶NemR
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PS突变体、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet
‑1‑
YsADH
‑
BmGDH
M6
/pET28a
‑
NemR
‑
PS
‑
D275G/F351A)经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以(E/Z)
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柠檬醛为底物，以葡萄糖为辅底物，加入助溶剂和辅酶NADP
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，以pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种老黄酶NemR
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PS突变体，其特征在于，所述老黄酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第275位天冬氨酸突变替换为甘氨酸，同时第351位苯丙氨酸突变替换为丙氨酸获得的。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述老黄酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第275位天冬氨酸突变替换为甘氨酸，同时第351位苯丙氨酸突变替换为丙氨酸获得的。3.一种权利要求1所述老黄酶NemR
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PS突变体的编码基因。4.一种含权利要求3所述老黄酶NemR
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PS突变体编码基因的重组基因工程菌。5.一种权利要求1所述老黄酶NemR
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PS突变体在催化柠檬醛制备(S)
‑
香茅醇的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：以共表达老黄酶NemR
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PS突变体、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以(E/Z)
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柠檬醛为底物，以葡萄糖为辅底物，加入助溶剂和辅酶NADP
+
，以pH 5.5～8.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～45℃、200～700rpm条件下转化反应12～24h，获得含(S)
‑
香茅醇的反应液，反应液分离纯化，获得(S)
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香茅醇；所述助溶剂为异丙醇。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂加入量以转化体系体积计为10～100g/L；底物加入终浓度以转化体系体积计为300～500mM；所述葡萄糖加入终浓度与底物加入终浓度的比值为0.5：1～5：1；所述NADP
+
加入终浓度以转化体系体积计为0～1.0mM；所述助溶剂体积加入量以转化体系体积计为0.5～8％。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将共表达老黄酶NemR
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PS突变体、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至O...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，王壹，魏春，冯彬斌，冯颖婷，张飞龙，肖延铭，应向贤，章银军，
申请(专利权)人：浙江英沃迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：