一种孤独症肠菌移植有效性的体外评价方法技术

本发明专利技术设计了一种孤独症肠菌移植的体外评价方法，采用模拟临床试验的整合方案，以移植前后香浓指数对比和孤独症特征菌相对定量指标为主要评价指标，解决了孤独症肠菌移植在临床应用细节中的主要不确定性问题。相比于动物模型和行为评价量表方法，具有试验周期短和可定量等优点，适于大批样本量的处理，提高了孤独症肠菌移植的效率。孤独症肠菌移植的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种孤独症肠菌移植有效性的体外评价方法


[0001]本专利技术涉及肠菌移植的体外评价方法，更具体地涉及孤独症肠菌移植有效性的体外评价方法，属于生物医药新


技术介绍

[0002]孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)是复杂的神经发育障碍，其核心症状是行为障碍和社交互动、沟通缺陷。患有ASD的人还经常出现包括肠道问题在内的共患疾病，这可能反映了大脑和肠道之间双向交流的异常。基于微生物群的孤独症疾病诊断模型揭示了ASD儿童存在明显偏离正轨的肠道菌群发育特征，这些特征与ASD儿童核心症状的严重程度显著正相关；大样本量临床研究发现是否患有 ASD对肠道菌群的影响不随年龄的变化而改变，提示组成异常的肠道菌群是ASD患儿的一个相对恒定的特征(Deviated and early unsustainable stunted development of gut microbiota in children with autism spectrumdisorder，Gut，2021；0：1
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12)，称之为孤独症特征菌群。Cell刊登题为“Human gut microbiota from Autism SpectrumDisorder promote behavioral symptoms in mice”的论文通过小鼠模型进一步证实了孤独症特征菌群和孤独症核心症状的关联性，提示肠道菌群改变是孤独症发病与治疗的关键环节。肠菌移植(Fecal MicrobiotaTransplantation，FMT)是将健康人粪便微生物通过一定方式移植到患者肠内，以调节肠道菌群失衡，重建具有正常功能的肠道微生态系统以治疗肠道疾病的一种新医疗技术。
[0003]目前肠菌移植已应用于改善孤独症行为症状和胃肠道症状。但肠菌移植对孤独症等肠外疾病的治愈率并不理想，治愈率在20
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23.5％。在孤独症治疗的临床应用中还存在以下问题：首先，由于ASD不是单一的病因，临床应用中缺乏有效鉴定用于诊断的生物标志物；再者，ASD是复杂的神经发育障碍，缺乏理想的动物模型来概括ASD的疾病状态，基于孤独症行为的评价量表(ABC、ADOS、DSM
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5、ADI
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R或者CARS)，不能有效与小鼠的行为症状相对应。由于临床试验受到伦理审查、动物模型试验质量等因素限制，肠菌移植干预措施对ASD患者胃肠道症状和行为症状的疗效还只能获得小样本量的提示性证据。而在肠菌移植临床试验手术过程中，不仅鼻肠管、鼻胃管、肠镜、结肠镜、灌肠手术环节给孤独症儿童带来难以接受的痛苦；而且这些临床方法还会发生误吸或者肠损伤等副作用(Future directions in reducinggastrointestinal disorders in children with ASD using Fecal Microbiota Transplantation，Frontiers in Cellular andInfection Microbiology，2021，11，1
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10)。因此，需要建立基于肠道微生物大样本量的体外试验来预评估肠菌移植的效果，以改善粪菌移植的依从性，提高孤独症肠菌移植临床应用的治愈率。

技术实现思路

[0004]本专利技术设计了一种孤独症肠菌移植有效性的体外评价方法：其特征在于包括以下步骤和方法：
[0005](1)健康供体初筛：采集健康供体和孤独症患者粪便样品通过宏基因组或16SrRNA测序检测供体(D) 和受体(R)样品多样性香浓指数Sd、Sr和其特征菌原始丰度值D、R；其特征在于健康供体初筛指标应满足(a)多样性香浓指数Sd大于3；(b)普雷沃氏菌属(Prevotella)、双歧杆菌属(Bifidobacter)、布劳特菌属(Blautia)原始丰度D/R＞1和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、梭菌属(Clostridium)、萨特菌属(Sutterella)原始丰度D/R＜1；
[0006](2)受体肠菌体外准备：将新鲜受体粪便样品添加万古霉素、聚乙二醇、菊粉、黄连素中至少一种，在氧浓度为0
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5％条件下处理4
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24h，获得清肠预处理受体肠菌；
[0007](3)供体、受体体外预配型：将步骤(1)检测获得的合格供体粪便样品按照重量百分比10％至40％移植接种到步骤(2)清肠预处理的受体肠菌中，并加3倍重量比的MG液体培养基混匀；供、受体混合菌液在氧浓度为0
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5％条件下培养48h，获得供、受体肠菌重组培养液；通过宏基因组或16SrRNA测序检测，确定重组培养液的多样性香浓指数St和孤独症特征菌群培养丰度终值T；
[0008](4)移植方案有效性评价：通过正交试验筛选有效移植的供体和受体组合及受体体外准备方案，有效移植判断指标为重组培养液的微生物组成满足：(a)香浓多样性指数St/Sr＞1；(c)普雷沃氏菌属丰度T/R＞1、双歧杆菌属丰度T/R＞1、布劳特菌属丰度T/R＞1和脱硫弧菌属丰度T/R＜1、梭菌属丰度T/R＜1、萨特菌属丰度T/R＜1中的至少三项。
[0009]所述的孤独症肠菌移植有效性的体外评价方法，其特征在于步骤(4)所述有效移植判断指标还包括重组培养液微生物组成满足普雷沃氏菌属/脱硫弧菌属丰度T的比值显著高于受体样品原始丰度R的比值。
[0010]所述的孤独症肠菌移植有效性的体外评价方法，所述孤独症特征菌丰度检测还可以采用叠氮溴化丙锭交联结合种属特异性16SrDNA荧光定量PCR方法进行活菌数绝对定量。
[0011]本专利技术的创新点和有益效果：
[0012]粪便微生物群移植(FMT)的潜在机制包括供体和受体肠道微生物群之间的直接相互作用或竞争以实现稳态、供体微生物群对宿主免疫的影响以及微生物群调节宿主代谢和生理的影响。基于供体微生物组成指标“和/或”微生物群的功能选择供体，可能对提高FMT的疗效很重要。针对孤独症FMT需要合理设计并严格控制，同时考虑到微生物多样性、组成功能和供体
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受体因素。
[0013]本专利技术所述肠菌移植的体外评价方法，采用模拟临床试验的整合方案，进行合理的孤独症肠菌移植流程设计，解决了肠菌移植在临床应用细节中的主要不确定性问题，：(1)首先基于本实验室供体/受体肠道检测的数据库以及国内外孤独症肠道菌群生物信息学分析成果(The human gut microbiome as a potentialfactor in Autism Spectrum Disorder.Inernational Journal of Molecular Sciences，2022，23，1363：1
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22；)，确定影响孤独症的关键微生物物种和FMT预测因素；相比于动物模型和行为评价量表，具有试验周期短和可定量等优点，适于大批样本量的处理，实质性改进孤独症肠菌移植的效率本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种孤独症肠菌移植有效性的体外评价方法；其特征在于包括以下步骤：(1)健康供体初筛：采集健康供体和孤独症患者粪便样品通过宏基因组或16SrRNA测序检测供体(D)和受体(R)样品多样性香浓指数Sd、Sr和其特征菌原始丰度值D、R；其特征在于健康供体初筛指标应满足(a)多样性香浓指数Sd大于3；(b)普雷沃氏菌属(Prevotella)、双歧杆菌属(Bifidobacter)、布劳特菌属(Blautia)原始丰度D/R＞1和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、梭菌属(Clostridium)、萨特菌属(Sutterella)原始丰度D/R＜1；(2)受体肠菌体外准备：将新鲜受体粪便样品添加万古霉素、聚乙二醇、菊粉、黄连素中至少一种，在氧浓度为0
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5％条件下处理4
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24h，获得清肠预处理受体肠菌；(3)供体、受体体外预配型：将步骤(1)检测获得的合格供体粪便样品按照重量百分比10％至40％移植接种到步骤(2)清肠预处理的受体肠菌中，并加3倍重量比的MG液体培养基混匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：张家树，
申请(专利权)人：北京富玛特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：