负载褪黑素细胞外囊泡及制备方法技术

本发明专利技术属于心肌损伤修复技术领域，公开了一种负载褪黑素细胞外囊泡及制备方法。制备方法包括如下步骤：获取尺寸可控的纳米细胞外囊泡，所述的纳米细胞外囊泡来自脂肪间充质干细胞；将褪黑素负载于所述的纳米细胞外囊泡得到所述的负载褪黑素细胞外囊泡。本发明专利技术的方法纳米囊泡的尺寸可控，回收率高，延长了药物半衰期。期。期。

【技术实现步骤摘要】
负载褪黑素细胞外囊泡及制备方法


[0001]本专利技术涉及心肌损伤修复
，具体涉及一种负载褪黑素细胞外囊泡及制备方法。

技术介绍

[0002]本专利技术对于
技术介绍
的描述属于与本专利技术相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本专利技术的
技术实现思路
，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本专利技术在首次提出申请的申请日的现有技术。
[0003]心肌梗死(MI)是缺血性心脏病(IHD)的一种，是全世界残疾和死亡的主要原因。心肌损伤是导致心肌梗死的最重要因素。
[0004]针对药物在体内递送的问题，由于药物在体内的半衰期比较低，影响实际治疗效果，会产生副作用。因此，已经开发出各种纳米给药载体来携带药物并将其运送到受伤部位。不幸的是，由于纳米载体的免疫原性和毒性、低载药量和生物分布问题，纳米载体在药物递送中的应用受到限制。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的目的是提供一种负载褪黑素细胞外囊泡及制备方法，本专利技术的方法纳米囊泡的尺寸可控，回收率高，延长了药物半衰期。
[0006]本专利技术实施例的目的是通过如下技术方案实现的：
[0007]一种负载褪黑素细胞外囊泡的制备方法，包括如下步骤：
[0008]获取尺寸可控的纳米细胞外囊泡，所述的纳米细胞外囊泡来自脂肪间充质干细胞；
[0009]将褪黑素负载于所述的纳米细胞外囊泡得到所述的负载褪黑素细胞外囊泡。
[0010]进一步的，所述的获取尺寸可控的纳米细胞外囊泡通过尺寸排阻法连续挤压脂肪间充质干细胞获得。
[0011]进一步的，将褪黑素负载于所述的细胞外囊泡采用超声法。
[0012]进一步的，所述的脂肪间充质干细胞经原代提取和培养后，洗涤、收集，然后以至少1
×
106个细胞/ml的浓度悬浮在PBS中。
[0013]进一步的，所述的尺寸排阻法为使用挤出机将细胞悬浮液依次挤出1μm、400nm和200nm聚碳酸酯膜，挤出五到六次。
[0014]进一步的，所述的将褪黑素负载于所述的纳米细胞外囊泡具体包括如下步骤：将褪黑素溶液混入纳米细胞外囊泡中，并使用超声波对混悬液进行处理；超声处理后，培养以恢复纳米囊泡膜，形成负载褪黑素细胞外囊泡。
[0015]进一步的，形成负载褪黑素细胞外囊泡后还包括步骤除去过量的游离褪黑素。
[0016]一种负载褪黑素细胞外囊泡，所述的负载褪黑素细胞外囊泡由上述的制备方法制备而得。
[0017]本专利技术实施例具有如下有益效果：
[0018]本专利技术方法在纳米原材料的选择上，选择脂肪间充质干细胞作为囊泡来源的材料，脂肪间充质干细胞本身就具有心肌损伤修复的能力，而其来源的囊泡不仅富含了亲本细胞的生物活性物质，同样具有修复能力，也拥有更好的生物相容性和免疫逃避能力，延长药物的体内的半衰期，增强药物的治疗效果。
[0019]在制备方法上，采用尺寸排阻法这种物理获取囊泡的方法实现获取囊泡的尺寸可控性以及高回收率，简化了获取囊泡的过程同时降低了成本。
[0020]在功能上，纳米囊泡不仅作为药物载体可以将抗氧化药物褪黑素递送至损伤部位，延长药物半衰期，同时脂肪间充质干细胞来源的纳米囊泡还具有心肌修复的能力，能够实现一次递送达到双重治疗效果。
[0021]本专利技术的制备方法简单有效，脂肪间充质细胞来源广泛，尺寸排阻挤出的物理方法操作简单，可以进行大量制备。
附图说明
[0022]图1为本专利技术负载褪黑素细胞外囊泡及其制备方法中通过尺寸排阻法获取的ADSCs来源的NVs的TEM图像以及粒径分析图。即通过透射电镜观察得到的纳米囊泡的形态，说明其与典型的外泌体的形态相似；并说明最初获得的囊泡量经1000倍稀释后的所测得的浓度为每毫升大概有1x106个囊泡，囊泡的粒径集中于100
‑
200nm之间，说明了囊泡获取尺寸的可控性。
[0023]图2为本专利技术负载褪黑素细胞外囊泡及其制备方法中通过超声将褪黑素负载于细胞外囊泡中的Mel@NVs以及对照NVs的TEM图像以及粒径分析图。通过透射电镜说明负载褪黑素细胞外囊泡的Mel@NVs与NVs相似，具有特征性的外泌体杯形结构，Mel@NVs平均大小为142.9
±
60.4nm，与NVs(144.6
±
59.3nm)大小相近，说明加载褪黑素后Mel@NVs的表面性质没有大的变化，粒径依然控制在100
‑
200nm之间，进一步说明了囊泡获取尺寸的可控性。
[0024]图3为本专利技术负载褪黑素细胞外囊泡及其制备方法中另一实施Mel@NVs应用实际效果的心脏超声图。将Mel@NVs在心肌梗死周边区进行心肌内注射，4周后通过M型超声心动图观察小鼠的心脏功能恢复情况。通过比较可以发现，经Mel@NVs处理的心梗小鼠，左心室射血分数以及左室短轴缩短率均比单独使用NVs处理的小鼠高，说明Mel@NVs能对梗塞心脏显示出更有效的心脏保护作用。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
[0027]申请人经大量研究发现：氧化应激是心肌损伤的重要病理生理机制，过量活性氧(ROS)的产生会损害细胞功能和活力。因此，提高心肌细胞存活率，抑制活性氧的产生和积累可能是改善缺血性疾病预后的关键。应用抗氧化药物可以有效地减轻氧化应激。褪黑素
可以通过多种方式抵抗氧化应激损伤，包括直接解毒和间接酶解活性氧物种。事实上，褪黑素是松果体分泌的一种吲哚杂环化合物。由于褪黑素具有抗氧化作用，可用于治疗疾病，因此褪黑素也被称为抗氧化药物。
[0028]申请人还发现，细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是由多种细胞类型分泌的天然微囊泡，具有良好的生物相容性、低细胞毒性、免疫惰性和长期循环能力。由于其纳米尺寸和良好的生物相容性，细胞外囊泡被认为是用于药物输送应用的天然载体。与常用的合成载体相比，EVs的高生物相容性使其成为药物递送的理想选择，而不会引起不良的促炎症和免疫反应。除了其独特的特性外，EV还富含来自母细胞的蛋白质、mRNAs和miRNAs等特定成分，因此它们在各种生理和病理过程中发挥关键作用，以移植原始细胞的自然生物功能，例如细胞增殖，分化和病毒传播，可直接用于治疗多种疾病。此外，来自间充质干细胞(MSC)的EV，如骨髓间充质干细胞(BMMSC)和ADSC，具有增强MI后心脏功能的能力，因为EV富含miRNA。MSCs衍生的EVs的miR
‑
143
‑
3p可通过抑制chk2
‑
beclin2途径来调节自噬，从而减少心肌细胞凋亡。同时，对微RN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载褪黑素细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：获取尺寸可控的纳米细胞外囊泡，所述的纳米细胞外囊泡来自脂肪间充质干细胞；将褪黑素负载于所述的纳米细胞外囊泡得到所述的负载褪黑素细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的负载褪黑素细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述的获取尺寸可控的纳米细胞外囊泡通过尺寸排阻法连续挤压脂肪间充质干细胞获得。3.根据权利要求1所述的负载褪黑素细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，将褪黑素负载于所述的细胞外囊泡采用超声法。4.根据权利要求1所述的负载褪黑素细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述的脂肪间充质干细胞经原代提取和培养后，洗涤、收集，然后以至少1
×
106个细胞/ml的浓度悬浮在PBS中。5.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张阳，曹丰，王亚斌，高姗，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第二医学中心，
类型：发明
国别省市：