一种重组工程菌及其用于高效转化L-泛解酸内酯的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组工程菌及其用于高效转化L

【技术实现步骤摘要】
一种重组工程菌及其用于高效转化L
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泛解酸内酯的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种重组工程菌及其用于高效转化L
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泛解酸内酯的应用。

技术介绍

[0002]D
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泛解酸内酯为用于合成维生素类药D
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泛醇及神经营养药D
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高泛酸钙的医药中间体，并用作饲料添加剂和日化产品的合成前体，年产量超过上万吨。工业制备D
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泛解酸内酯常采用化学法和拆分法相结合的方法，包括下述步骤：异丁醛和甲醛发生羟醛缩合生成羟基特戊醛，再和氰基反应生成氰醛，水解生成DL
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泛解酸内酯外消旋体，采用化学拆分和酶拆分，制得D
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泛解酸内酯。但拆分产生大量L
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泛解酸内酯，如不合理利用将造成资源浪费，增加生产成本。
[0003]《化学酶法合成D
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泛解酸内酯的研究进展》(汪钊等，发酵科技通讯，第45卷第4期)公开了DL
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泛解酸内酯经L
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泛解酸内酯脱氢酶生成酮泛解酸内酯，再经酮泛解酸内酯还原酶还原得到D
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泛解酸内酯，该方法中L
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泛解酸内酯脱氢酶的脱氢效率低。还公开了L
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泛解酸内酯经L
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泛解酸内酯脱氢酶反应得到酮泛解酸内酯，自发水解生成酮泛解酸，再经酮泛解酸还原酶还原得到D
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泛解酸，酸性闭环，制得D
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泛解酸内酯。该方法因L
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泛解酸内酯脱氢酶的反应效率低下，且自发水解在实际实验中较难控制，基本未得到D
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泛解酸内酯，实验难以重现。
[0004]CN110423717A公开了一种多酶重组细胞及多酶级联催化合成D
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泛解酸内酯的方法，该方法使用L
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泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶组成的三元复合酶转化生产D
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泛解酸内酯。但葡萄糖脱氢酶易诱导生成反应副产物葡萄糖酸，导致D
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泛解酸内酯的分离困难，且产生大量废料，增加处理困难。为此，需要开发高转化率的D
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泛解酸内酯制备方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组载体，所述重组载体选自含有L
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泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组载体。
[0006]本专利技术的优选技术方案中，L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示分别在第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体和第四重组载体上。
[0007]本专利技术的优选技术方案中，所述重组载体任选地包括第四重组载体或第五重组载体的任一种，其中，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第五重组载体包含L
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泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所
示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术的优选技术方案中，所述重组载体选自第一重组载体包含L
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泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]本专利技术优选的技术方案中，所述重组载体用于L
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泛解酸内酯制备DL
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泛解酸内酯。
[0010]本专利技术优选的技术方案中，所述第一重组载体包括L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因，优选所述L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因源自红串红球菌、红球菌、分支杆菌、诺卡氏菌、链霉菌、放线菌中的任一种。
[0011]本专利技术优选的技术方案中，所述L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到L
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泛解酸内酯脱氢酶基因序列。
[0012]本专利技术优选的技术方案中，酶切位点选自XhoI、NdeI的任一种或其组合。
[0013]本专利技术优选的技术方案中，所述L
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泛解酸内酯脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因1，所述目的基因1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]本专利技术优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因源自木兰假丝酵母、小单孢菌、链霉菌中的任一种。
[0015]本专利技术优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到酮泛解酸内酯还原酶基因序列。
[0016]本专利技术优选的技术方案中，酶切位点选自SacI、NotI的任一种或其组合。
[0017]本专利技术优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶基因序列经人工合成制得目的基因2，所述目的基因2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018]本专利技术优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶编码基因源自伯克霍尔德菌、大肠杆菌、气单胞菌中的任一种。
[0019]本专利技术优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶编码基因经密码子优化并加上酶切位点得到甲酸脱氢酶基因序列。
[0020]本专利技术优选的技术方案中，酶切位点选自EcoRI、NotI的任一种或其组合。
[0021]本专利技术优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因3，所述目的基因3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0022]本专利技术的优选技术方案中，所述密码子优化根据大肠杆菌的密码子偏好性进行。
[0023]本专利技术优选的技术方案中，用于重组的载体选自pET
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21a质粒、pET
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28a质粒、pRSFDuet
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I质粒的任一种或其组合。
[0024]本专利技术优选的技术方案中，所述第一重组载体的获得方法包括下述步骤：将L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到第一载体中，得到第一重组载体。
[0025]本专利技术优选的技术方案中，所述第二重组载体的获得方法包括下述步骤：将酮泛解酸内酯还原酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到第二载体中，得到第二重组载体。
[0026]本专利技术优选的技术方案中，所述第三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，所述重组载体选自含有L
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泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组载体。2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体任选地包括第四重组载体、第五重组载体的任一种，其中，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第五重组载体包含L
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泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种重组工程菌，所述重组工程菌包括能够表达L
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泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、表达酮泛解酸内酯还原酶的第二重组载体和表达甲酸脱氢酶的第三重组载体的任一种或其组合；和/或，所述重组工程菌包括能够共表达酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第四重组载体；和/或，所述重组工程菌包括能够共表达L
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泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第五重组载体。4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其中，所述重组工程菌包含能够表达L
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泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、共表达酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶的第四重组载体。5.一种重组工程菌的构建方法，包括下述步骤：(1)将L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因、酮泛解酸内酯还原酶编码基因、甲酸脱氢酶编码基因的任一种或其组合顺序或同步导入载体，得到重组载体；(2)将所得重组载体导入宿主细胞，得到重组工程菌。6.一种DL

【专利技术属性】
技术研发人员：周芳芳，刘树蓬，刘磊，张大伟，刘美霞，
申请(专利权)人：巴彦淖尔华恒生物科技有限公司秦皇岛华恒生物工程有限公司合肥华恒生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：