用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测试剂技术方案

本发明专利技术公开了一种用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测试剂，其特征在于：包括检测EB病毒、流感嗜血杆菌、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒2型、水痘带状疱疹病毒、钩端螺旋体、B

【技术实现步骤摘要】
用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测试剂


[0001]本专利技术属于生物
，针对引发中枢神经系统感染性疾病常见8种病原体，建立特异性强、灵敏度高、反应快速的多重荧光定量PCR检测方法。

技术介绍

[0002]中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）感染性疾病指的是细菌、病毒、真菌等病原体侵犯CNS的脑膜、实质、血管导致的慢性或急性炎症或非炎症性的疾病。中枢神经系统感染性疾病有三种不同的分类，临床上依据中枢神经系统感染部位的不同可分为：（1）脑炎、脊髓炎或脑脊髓炎，病原体主要侵犯脑和(或)脊髓实质，其中最常见的疾病为脑炎，据报道感染性脑炎的发病率为1.5
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7例/100000人/年。（2）脑膜炎、脊膜炎或脑脊膜炎，主要侵犯脑和(或)脊髓软膜，其中脑膜炎是最常见的CNS感染性疾病，脑膜有三层，由外向内为硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑膜炎可累及硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，目前临床上的脑膜炎实际上是指软脑膜炎。脑膜炎是一类特别严重的疾病，需要及时治疗，如果治疗不及时，可能会造成死亡或留下一些后遗症。（3）脑膜脑炎指的是脑膜与脑实质合并感染。脑膜脑炎是一种病毒性疾病，发生在蛛网膜和软脑膜之间。确定了CNS感染性疾病常见的8种病原体有EB病毒（Epstein
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Barr Virus，EBV）、猿猴空泡病毒40（Simian Vacuolating Virus SV40）、2型单纯疱疹病毒（Herps Simplex Virus 2，HSV
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2）、水痘带状疱疹病毒（Varicella
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Zoster Virus，VZV）、巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、诺卡菌（Nocardiosis）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、B
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溶血性链球菌（β
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Streptococcus haemolyticus）、钩端螺旋体（Leptospira）等会导致严重的后果。
[0003]病毒感染是人类中枢神经系统感染的主要原因，在儿童群体中感染率最高。CNS的真菌感染可能是毁灭性的并且难以治疗，相关死亡率超过90%。细菌感染可能会致命或在幸存者中留下严重的CNS后遗症。快速准确的检测中枢神经系统的病原体对疾病的治疗是非常必要的。目前常用的脑脊液病原体的检测方法存在一些弊端，比如脑脊液病原体分离培养法培养时间长（2
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5天），很多病原体要求的培养条件非常严格，可能会延误病情，错过最佳治疗时期，且检测灵敏度低。免疫学检测和普通PCR的方法对病原体的检测也都有灵敏度低的特点。近几年新兴的基因芯片法和mNGS的方法虽然检测灵敏度很高，但价格昂贵，且需要专业人员操作。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测试剂，其包括检测EB病毒、流感嗜血杆菌、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒2型、水痘带状疱疹病毒、钩端螺旋体、B
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溶血性链球菌、诺卡菌的特异性引物和探针；包括GAPDH基因的引物和探针；还包括多重荧光定量PCR检测的其他常规试剂；本专利技术检测试剂具有检测灵敏度高、特异性强、重复性良好，对仪器设备要求不高、操作简便、所需时间短等
优点，因此具有较大的应用价值。
[0005]所述特异性引物为针对EB病毒的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、针对流感嗜血杆菌的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、针对巨细胞病毒的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、针对单纯疱疹病毒2型的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11、针对水痘带状疱疹病毒的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、针对钩端螺旋体的SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17、针对B
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溶血性链球菌的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；针对诺卡菌的SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；所述探针为针对EB病毒的SEQ ID NO:3、针对流感嗜血杆菌的SEQ ID NO:6、针对巨细胞病毒的SEQ ID NO:9、针对单纯疱疹病毒2型的SEQ ID NO:12、针对水痘带状疱疹病毒的SEQ ID NO:15、针对钩端螺旋体的SEQ ID NO:18、针对B
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溶血性链球菌的SEQ ID NO:21；针对诺卡菌的SEQ ID NO:24。
[0006]使用上述多重荧光定量PCR检测试剂的方法如下：1、样品核酸（DNA）提取，样品为脑脊液；2、以步骤（1）核酸为模板，采用靶向8种病原体的特异性引物和探针，经过多重实时荧光定量PCR进行检测，以GAPDH基因为内参，根据Ct值进行结果判定；在检测中检测 EB病毒、流感嗜血杆菌、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒2型的特异性引物和探针同时使用；检测水痘带状疱疹病毒、钩端螺旋体、B
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溶血性链球菌、诺卡菌的特异性引物和探针同时使用；以GAPDH基因为内参。
[0007]检测8种病原体及内参基因的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑ꢀ
SEQ ID NO.24所示；GAPDH内参基因序列如SEQ ID NO.25
‑
27所示。
[0008]采用本专利技术多重荧光定量PCR检测试剂检测病原体的扩增反应体系如下：2
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Pro Taq HS Probe Premix 20μL、4种病原体及内参GAPDH基因上下游引物和探针各1μL、DNA模板4μL、ddH2O补足至40μL。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性3s，58℃退火并延伸30s，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
[0009]3、检测阳性结果判读包括如下内容：（1）内参（GAPDH基因）Ct值≤36，阴性对照组、无模板对照组无Ct值；如不符合须再次进行多重实时荧光定量PCR检测，或重新提取核酸进行多重实时荧光定量PCR检测；（2）病原体Ct值≤36.0，若Ct值＞36.0，需要针对该病原体进行单重实时荧光定量PCR验证；（3）扩增曲线呈标准“S”型且无异常波动。
[0010]本专利技术与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和技术效果：本专利技术建立了8种中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测方法，对该方法进行特异性评价发现每组病原体与其他组外病原体之间均无交叉反应，各组病原体的特异性良好；灵敏度评价发现除巨细胞病毒的灵敏度均达到100copies/μL量级外另外其他7种病原体的灵敏度均达到10 copies/μL量级，灵敏度很高；对该方法进行重复性评价发现各组病原体在批间和批内的变异系数（CV）均小于5，重复性良好；通过检测20例脑脊液临床样本进行MqPCR准确性评价，结果发现MqPCR方法准确性良好。
附图说明
[0011]图1为E本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量PCR检测试剂，其特征在于：包括检测EB病毒、流感嗜血杆菌、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒2型、水痘带状疱疹病毒、钩端螺旋体、B
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溶血性链球菌、诺卡菌的特异性引物和探针；所述特异性引物为针对EB病毒的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、针对流感嗜血杆菌的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、针对巨细胞病毒的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、针对单纯疱疹病毒2型的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11、针对水痘带状疱疹病毒的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、针对钩端螺旋体的SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17、针对B
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溶血性链球菌的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽，袁丽娜，冯悦，夏雪山，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：