重组A型肉毒素的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种重组A型肉毒素的制备方法。所述方法包括：采用基因重组的方法进行制备，构建分别表达轻链蛋白、重链蛋白的基因工程菌；将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；将所述第一变性产物和第二变性产物按比例混合，进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。本发明专利技术的方法工艺简单、制备流程短，制备得到的A型肉毒素的纯度高、毒性高。毒性高。

【技术实现步骤摘要】
重组A型肉毒素的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及一种重组A型肉毒素的制备方法，更具体地，本专利技术涉及一种基因重组制备A型肉毒素的方法和A型肉毒素。

技术介绍

[0002]肉毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)是一种由厌氧肉毒梭状芽孢杆菌(简称“肉毒梭菌”)产生的神经毒素，是世界上已知毒性最强的物质之一，肉毒素分为7种类型的血清型(A型
‑
G型)，其中最常见的为A型，称为A型肉毒素(Botulinum neurotoxin of type A，BoNT/A)。多项研究表明，BoNT/A具有广泛的应用前景，不仅在医学美容方面，随着在各种肌张力障碍、手足多汗症、疼痛以及其他疑难杂症等领域的临床应用，其治疗范围在不断扩大。
[0003]BoNT/A的结构分为两部分：轻链(LC，50kD)和重链(HC，100kD)，轻链和重链间靠一对二硫键链接(C430
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C454)，非酰胺键链接。轻链为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性，是毒素的毒性部分；重链包含两个结构域，结合结构域和转位结构域，结合结构域负责与神经细胞膜上相应受体结合，并在内体膜上形成离子通道，转位结构域负责轻链的转位，将轻链移送至细胞内，轻链识别SNAP
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25(一种突触囊泡相关蛋白)上的Q197
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R198位点，对其进行特异性切割。
[0004]天然结构的活性BoNT/A蛋白，重链内具一对二硫键(C1235/>‑
C1280)，轻链、重链间具一对二硫键(C430
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C454)。
[0005]BoNT/A的治疗机理为，在神经肌肉接头处，BoNT/A与神经细胞表面的相应受体结合，借助其重链N端，跨膜将轻链移送至细胞内，通过切割SNAP25来阻断乙酰胆碱的释放，引发肌肉持续的松弛性麻痹。
[0006]然而，在传统的制备BoNT/A的方法中，存在制备BoNT/A工艺繁杂、制备流程长、含大量非BoNT/A组分(如HA、NTNH)、纯度低等缺陷。因此，亟需开发一种新的制备BoNT/A的方法，获得高纯度的BoNT/A。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种利用基因重组制备A型肉毒素的方法，本专利技术的方法工艺简单、制备流程短，制备的A型肉毒素不含非BoNT/A组分(如HA、NTNH)、纯度高、毒性高。
[0008]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0009]自然状态下BoNT/A由肉毒梭菌产生，BoNT/A与血凝素(Hemagglutinin，HA)和非毒素非血凝素(Non
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toxic non
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HA，NTNH)通过非共价键组成BoNT/A复合物。目前，国内外市售BoNT/A制品大多数为BoNT/A复合物，注射后，BoNT/A复合物在偏碱性体液中非共价键被破坏，解离为独立的BoNT/A、HA和NTNH分子，BoNT/A扩散或随血液循环到达靶位点发挥作用，HA和NTNH不具有功能性作用，但具有凝血的副作用和刺激机体免疫系统产生抗体的风险。
[0010]目前，BoNT/A的制备方法有以下2种：
[0011]一是肉毒梭菌培养液提取制备BoNT/A，是目前已上市BoNT/A产品的通常制备方法。完整制备过程需16个步骤完成，包括肉毒梭菌培养、培养液过滤、超滤、凝胶层析等一系列步骤，最终得到BoNT/A原液。该制备方法提取步骤繁杂、流程长，完整流程需要15
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20天时间，效率低。BoNT/A原液纯度低，除了含BoNT/A外，还含HA及NTNH等组分，具凝血、过敏等不良反应风险，不宜长期使用。
[0012]二是大肠杆菌发酵制备BoNT/A，该制备方法在专利号为US10307468B2的专利中有记载。具体为，对转化了目标蛋白基因的大肠杆菌进行发酵，发酵液经离心、细胞破碎及系列纯化过程后，进行毒性激活，制备BoNT/A原液。其制备产物为单组份，只含BoNT/A，但由于目标蛋白毒性激活需要加入Lys
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C酶，虽然设计了纯化步骤将其除去，但依然会有少量Lys
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C酶残余。这会产生两方面的不利作用，其一，外源Lys
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C酶的引入，会导致终产品中有外源Lys
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C酶的残留，影响生物药物的质量，存在很大的用药安全隐患。其二，Lys
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C酶在很低的浓度下依然具有活性作用，其底物为BoNT/A，很容易产生在非目标激活位点的非特异性切割，导致轻链、重链的不均一性，影响产品质量，这同样存在很大的用药安全隐患。
[0013]理想的BoNT/A产品应具有如下特征：(1)使用安全菌株生产，代替肉毒梭菌，肉毒梭菌是自然界中最具毒性菌株之一，使用过程具高度危险性。(2)应具有单亚型、单组份，不含除BoNT/A型以外的任何血清亚型，不含HA、NTNH等非BoNT/A组分。(3)具有正确的高级结构构象，不含因序列不均一产生的序列异质体，适合长期使用。(4)BoNT/A的毒性激活不依靠外源工具酶产生，没有工具酶残留，避免对蛋白质的二次污染带来的安全风险。(5)提取步骤应简洁高效，流程短。(6)杂质少、纯度高，批次间质量均一。
[0014]但是，上述提到的两种方法均不能制备出理想的BoNT/A产品。
[0015]为了避免肉毒梭菌使用带来的安全风险、获取具有正确高级结构的不含序列异质体的BoNT/A蛋白，避免BoNT/A长期使用产生不良反应的风险，专利技术人通过对BoNT/A蛋白的高级结构、蛋白质特性进行研究和分析，发现部分表达体系(例如大肠杆菌B系列表达体系)能够直接表达BoNT/A的轻链蛋白和重链蛋白，表达的轻链蛋白和重链蛋白均以包涵体的形式存在，经变性、体外复性及组装后可以形成完整的BoNT/A分子，该方法的制备过程中无需使用蛋白酶进行毒性激活，可避免外源工具酶的残留及因切割不完全或非特异性切割而出现的非活性异构杂质体，同时无需单独表达完整BoNT/A分子，避免了因蛋白分子过大而形成错误高级结构的倾向和风险。并且，专利技术人还经过大量实验，筛选得到了本专利技术的复性及组装缓冲液，通过该复性及组装缓冲液可降低轻链蛋白和重链蛋白折叠过程中二硫键的错配，提高轻链蛋白和重链蛋白的正确复性及组装率，提高组装液中目标蛋白(BoNT/A)的含量。同时，专利技术人还经过大量实验，发现纯化步骤对BoNT/A的纯度有显著影响，依次采用疏水层析、硫酸铵盐析、透析、阴离子层析和分子筛层析处理的纯化体系，可得到纯度达98.0％以上的BoNT/A蛋白。
[0016]本专利技术所提出的BoNT/A制备方法简洁、高效，制备流程短，获得目标蛋白(BoNT/A)的纯度高，只需经过8个步骤、4
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5天的时间即可完成全流程制备，制备得到具有正确结构构象的单亚型、单组份BoNT/A，该BoNT/A中不含HA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因重组制备A型肉毒素的方法，其特征在于，包括：将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；将所述第一变性产物和第二变性产物进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述轻链蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；任选地，所述重链蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述轻链蛋白或重链蛋白是通过如下方式获得的：将质粒导入大肠杆菌中，所述质粒携带编码所述轻链蛋白或重链蛋白的基因；将导入有所述质粒的大肠杆菌在适于蛋白表达的条件下进行培养、诱导，离心收获菌体、菌体破碎、离心破碎产物，获得所述轻链蛋白或重链蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一变性处理和所述第二变性处理在变性缓冲液中进行，所述变性缓冲液包括：5～10M尿素、5～15mM二硫苏糖醇和10～30mM Tris或Tris
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HCl；任选地，所述变性缓冲液的pH值为9.5～10.5。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，进行所述复性及组装处理之前，预先将所述第一变性产物和所述第二变性产物进行混合处理，得到变性混合液；任选地，所述混合处理中所述第一变性产物和所述第二变性产物的体积比为1:(1～10)；任选地，所述复性及组装处理在复性及组装缓冲液中进行，所述复性及组装缓冲液包括：50～150mM NaCl、0.1～1.0mM ZnCl2、0.1～1.0mM CaCl2、1.0～10.0mM还原性谷胱甘肽、1.0～10.0mM氧化性谷胱甘肽、40～50mM Tris
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HCl和0.4～0.6％吐温20；任选地，所述复性及组装缓冲液的pH值为9.5～10.5；任选地，所述变性混合液与复性及组装缓冲液的体积比例为1:(1～10)。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述复性及组装处理的处理时间为12～16h；任选地，所述复性及组装处理的搅拌转速为50～200rpm。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将所述复性及组装处理得到的组装液依次经过疏水层析、硫酸铵盐析、透析、阴离子层析和分子筛层析处理，获得所述A型肉毒素。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述疏水层析处理的流动相A1包括10～30mmol/L Tris...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭力鸣，包国庆，沈玉保，李佳男，吴琪，孙宝财，蔡元宁，王超，高欣，马庆男，
申请(专利权)人：君合盟生物制药杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：