一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法，预先合成带有CY5基团的miR

【技术实现步骤摘要】
一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法。

技术介绍

[0002]目前，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是引起世界范围慢性病毒性肝病的主要病因之一，其引起的丙型肝炎最终可导致肝硬化甚至肝细胞癌。由于目前尚缺乏HCV的疫苗，且其具体的致病机制尚未被完全阐明。研究表明宿主因素与HCV的感染、致病过程及患者治疗效果有密切关系，因此对其进行研究将有助于HCV感染的预防和个体化治疗。
[0003]microRNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA，具有调控细胞分化、增殖、凋亡和代谢等多种生物学功能，同时参与感染性疾病、代谢性疾病及肿瘤等多种疾病的发生过程。miRNA通过结合靶标基因的非编码区来抑制mRNA的翻译过程或降解mRNA，进而调控转录后基因表达过程。近年来，越来越多的miRNA被证实与HCV的感染密切相关。
[0004]microRNA
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206(miR
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206)位于人类6号染色体上，在脊椎动物中高度保守。miR
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206首次按在骨骼肌中被发现，并被认为是骨骼肌特异性表达microRNA。随后，在心脏、肺、脑和肝脏等组织中也发现miR
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206的表达，并且参与到这些器官的生理和病理反应过程中。目前为止，miR
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206已被证实与乳腺癌、结肠癌、横纹肌肉瘤等肿瘤的发生具有相关性。最近发现在肝细胞癌的患者中miR
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206的表达量明显低于正常人，并且其表达量与肝癌细胞的分化程度、癌细胞的结节数量、淋巴结转移以及肝癌的进展等相关，体外实验证实miR
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206可以减少肝癌细胞的增殖、浸润和转移速度，并能加速其凋亡，但是具体的致病机制尚未完全阐明。目前对于miR
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206与肝细胞癌的研究较少，部分研究证实miR
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206在肝组织代谢过程中发挥重要作用，但尚未见miR
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206与HCV复制增殖的相关报道。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0006](1)由于目前尚缺乏HCV的疫苗，且其具体的致病机制尚未被完全阐明。
[0007](2)尚未见miR
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206与HCV复制增殖的相关报道，其可能是潜在的HCV治疗药物。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种micorRNA206抑制HCV增殖的实验方法及检测方法。
[0009]本专利技术所述micorRNA206抑制HCV增殖方法和检测方法的建立包括：
[0010]miR
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206转染入HCV感染的细胞过表达，通过荧光定量PCR检测miR
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206相对表达量，并通过评估HCV的病毒载量及蛋白表达量分析microRNA
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206的抑制效果。
[0011]进一步，所述micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法还包括：
[0012]预先合成带有CY5基团的miR
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206模拟物，确定最佳感染复数与转染量，并通过激光共聚焦与qRT
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PCR分别检测miR
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206的转染效率以及表达量；验证HCV病毒感染12h后，过
表达miR
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206对HCV病毒增殖的抑制作用。
[0013]进一步，所述HCV病毒载量检测引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，探针序列为SEQ ID NO：3。
[0014]SEQ ID NO：1：tgctcatgat gcacggtcta c
[0015]SEQ ID NO：2：tgcggaaccg gtgagtacat
[0016]SEQ ID NO：3：caccctatca ggcagtacca caaggcc
[0017]进一步，所述检测miR
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206表达量引物的序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
[0018]SEQ ID NO：4：cttcccgagg ccacatgc
[0019]SEQ ID NO：5：cacttgccga aaccacac
[0020]进一步，所述micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法包括以下步骤：
[0021]步骤一，确定HCV对细胞的感染复数，以达到最优的HCV感染效果；
[0022]步骤二，转染试剂用量与miR
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206转染浓度的确定，使miR
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206转染浓度和比例达到最佳水平；
[0023]步骤三，miR
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206表达量的检测，确定miR
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206转染成功；
[0024]步骤四，HCV病毒载量及蛋白的检测，检测miR
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206对HCV的抑制效果。
[0025]更详细的步骤为，设置不同感染复数对细胞进行感染，在感染12h后，通过间接免疫荧光确定HCV感染复数。
[0026]进一步，所述感染复数MOI＝0.1、0.3、1、2、3。
[0027]进一步，所述步骤二中，设置不同转染试剂LipofectamienTM 3000与miR
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206mimics用量，在转染24h后通过qPCR检测miR
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206表达情况，确定转染试剂与miR
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206mimics的最佳用量。
[0028]进一步，所述不同转染试剂LipofectamienTM 3000的体积依次为0.75μL、1.5μL和3μL；20nM miR
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206mimics转染体积为0.5μL、1.5μL和2.5μL。
[0029]进一步，通过CCK
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8试剂盒检测HCV病毒感染与转染miR
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206mimics对细胞活性的影响。
[0030]结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0031]第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0032]本专利技术旨在建立microRNA
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206(miR
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206)抑制HCV增殖的实验方法，主要提供miR
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206转染入细胞过表达，并通过荧光定量PCR检测miR
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206相对表达量，通过评估HCV的病毒载量及其蛋白表达量分析mic本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法，其特征在于，所述micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法包括：miR
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206转染入细胞过表达，通过荧光定量PCR检测miR
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206相对表达量，并通过评估HCV的病毒载量及蛋白表达量分析microRNA
‑
206的抑制效果。2.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法，其特征在于，所述micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法还包括：预先合成带有CY5基团的miR
‑
206模拟物，确定最佳感染复数与转染量，并通过激光共聚焦与qRT
‑
PCR分别检测miR
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206的转染效率以及表达量；验证HCV病毒感染12h后，过表达miR
‑
206对HCV病毒增殖的抑制作用。3.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法，其特征在于，所述HCV病毒载量检测引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，探针序列为SEQ ID NO：3。4.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法，其特征在于，所述检测miR
‑
206表达量引物的序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。5.如权利要求1所述的micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法，其特征在于，所述micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法包括以下步骤：步骤一，确定HCV对细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张阿梅，刘妮，夏雪山，郑克溪，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：