一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法技术

本发明专利技术是一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法，其步骤包括：对待检测鲍进行实验室驯化；连接鲍心跳检测装置并开机，将红外探头粘贴在临近鲍心脏位置的壳表面，鲍心跳信号经红外探头获取、AMP03放大器放大、Powerlab信号接受仪采集后，导入电脑进行分析；由待测鲍的上足位置进行鲍源致病菌注射；病菌胁迫过程使用LabChart软件实时连续记录鲍心跳信号，采集结束后对心率进行统计分析；根据鲍在胁迫过程的心跳规律，开发出病菌胁迫心率拐点CBTB和病菌胁迫心率归零点CZTB两个指标，并根据CBTB和CZTB数值评估鲍的抗病能力。本发明专利技术的测评方法具有实时、准确、直观、可量化等优点，可实现对大批量实验鲍的同步评估，可应用于鲍的不同群体或基因型之间的病菌耐受性比较研究。群体或基因型之间的病菌耐受性比较研究。群体或基因型之间的病菌耐受性比较研究。

【技术实现步骤摘要】
一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法


[0001]本专利技术涉及水产养殖
，具体为一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法。

技术介绍

[0002]鲍，隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeo gastropoda)、鲍科(Haliotididae)，其肉质滑嫩，滋味鲜美，是一种营养价值很高的海产品。上世纪七十年代，杂色鲍和皱纹盘鲍人工育苗取得突破，并逐步开展工厂化养殖。90年代早期，福建、广东等南方沿海省份通过引进吸收，建立了杂色鲍陆基工厂化养殖技术，自此鲍大规模养殖产业开始发展。2000年，原养殖于辽宁省的皱纹盘鲍被引入福建，结合福建海域环境，逐步建立起规模化浅海筏架式养殖模式，使得皱纹盘鲍的养殖规模和产量得到了爆发式增长，并逐步成为我国鲍主导性养殖品种。据联合国粮食及农业组织(FAO)统计，2019年我国的鲍养殖产量达18.03万吨，占世界养殖总产量的90％以上，其中福建省的鲍养殖产量为14.3万t，占全国鲍养殖产量的79.3％。鲍因其较高的经济效益，已成为福建省产值第一的水产养殖种类。鲍养殖产业的发展壮大带动了鲍养殖器材、海藻养殖、配合饲料、加工和运输业等行业的快速发展，现已形成完整的产业链，创造了巨大的经济效益、社会效益和生态效益。目前，我国鲍的人工养殖主要集中于福建、山东和广东三省。皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)目前是我国的主要经济鲍种，杂色鲍(Haliotis diversicolor)则在南方一些省份有部分养殖。
[0003]病害一直是影响鲍养殖业产量的不利因素之一。鲍作为水生动物，其内分泌环境与外界水环境之间存在较强的物质交换，因此容易受到环境有害微生物的胁迫。病害会对鲍的生长、发育、繁殖、代谢、行为等生理活动规律造成影响。对有害微生物的免疫能力，被认为是经济贝类的一个重要性状，它在一定程度上决定了养殖贝类在养殖过程的存活率，从而直接影响其最终产量。基于产业和理论的需求，需要建立测定海洋贝类免疫耐受性的方法。早期多通过对某种贝类进行急性或慢性的病原胁迫，测定其存活率或半致死浓度(50％Lethal concentration,LC50)来评估其耐免疫耐受性。该方法能够较直观地反映贝类免疫能力，然而该方法也存在一定的缺陷，其测定过程比较长(一般至少需要96h)，且测定过程中需要牺牲大量实验动物，也无法获知贝类免疫活动的生理机制。后来，研究者们结合了其他生理测定手段如细胞免疫参数测定(血细胞数量、血细胞吞噬活力、血细胞呼吸爆发能力)及体液免疫参数测定(免疫相关酶活性)等，来综合评价和解释海洋贝类的免疫耐受特征，然而，这些方法也只能间接、部分地反映贝类的免疫能力，直观性和灵敏性不足。因此，需要一种便捷、可靠、直观的方法来测定海洋贝类物种的免疫耐受性。
[0004]利用红外原理检测贝类心跳，一直是一种简单、快捷、精准度高的反映贝类生理状态变化的技术手段。早在1990年，研究者们便成功使用红外检测的方法，观察到了几种甲壳动物和贝类的稳定心跳。后来，研究者们将心跳检测用于研究温度对贝类生理状态的影响，Stillman等人使用了阿伦尼乌斯拐点温度(Arrhenius break temperatures，ABT)来体现
瓷蟹对高温的耐受能力，他们发现在一定温度范围内，蟹的心率随温度上升而上升；超过某一温度点之后，蟹的心率则随温度上升而下降。这一拐点温度点便是ABT，它代表了无脊椎动物耐受高温的极值，超过该温度，生物的代谢功能下降或失衡，表现为心率下降。而这个ABT的值，可以通过计算ABT前后两条线性阿伦尼乌斯方程的交点而获得。ABT目前已经广泛被用于贝类物种如鲍、扇贝、对虾、滨螺、帽贝、贻贝等的耐高温能力评价。后来，研究者们又成功地将心跳指标用于评估鲍、扇贝、小龙虾等无脊椎动物对低温、缺氧、干露、酸化等不利环境因素的响应，并据此开发出鲍拐点溶解氧(Breakpoint dissolved oxygen，BPDO)、扇贝心跳抗性综合指标(Yi)等能够指示贝类对特定环境因素的抗性的指示指标。
[0005]然而，目前尚无对病原胁迫下鲍的心跳变化模式的研究。阐述鲍在病原胁迫下的心跳功能变化，并据此开发出准确、可靠、可量化的病原耐受心跳指标，将有助于我们了解海洋无脊椎动物在病菌胁迫下的心跳变化规律及特征，即可应用于鲍的不同群体或基因型之间的病菌耐受性比较，也可作为育种指标应用于鲍抗病遗传育种工作中。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法，该方法通过Powerlab心跳检测系统，实时检测并记录鲍在注射病菌后的心跳波形，并通过LabChart软件计算和分析鲍的心跳频率。以病菌胁迫下鲍心跳波形和心率频率的变化为依据，开发出鲍免疫心跳的指示指标，直观地展示病菌胁迫下鲍心跳的变化规律，也有利于比较不同鲍的群体或基因型之间的免疫特性。本专利技术的提出，有助于解决目前缺乏实时、准确、直观、可量化的鲍(及其他海洋无脊椎动物)抗病性测评方法缺失的问题。
[0007]一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法，包括以下步骤：
[0008]步骤一，待检测鲍在室内可控的驯化条件下进行7
‑
14天的驯养，使其适应实验室环境；
[0009]步骤二，测评前连接好鲍心跳检测装置；
[0010]步骤三，清理鲍壳表面的附着物，擦去水分；打开鲍心跳检测装置的Powerlab信号接收仪及电脑的电源，设置电脑内的LabChart软件处于信号获取状态，将鲍心跳检测装置的红外探头抵紧鲍心脏位置的鲍壳表面，同时观察LabChart软件中检测到的心跳波形状态，微调红外探头位置使心跳波形规律、清晰；然后使用强力粘合胶水，将红外探头粘贴在相应的壳表面位置；
[0011]步骤四，将粘贴好探头的鲍放入暂养槽，在20
‑
25℃下进行2
‑
4小时的暂养，使其适应检测环境；
[0012]步骤五，由实验鲍的上足位置进行50
‑
100uL的鲍源致病菌注射；
[0013]步骤六，在病菌胁迫过程中，使用LabChart软件实时记录鲍心跳信号，直至所有实验鲍的心跳停止正常跳动后结束记录，采集结束后对鲍心率进行统计分析；
[0014]步骤七，根据鲍在病菌胁迫过程的心跳规律，定义鲍心率开始下降时减去病菌注射时间的拐点时间为鲍病菌胁迫心率拐点，鲍心率下降至零点的时间为病菌胁迫心率归零点；结合CBTB和CZTB两个指标，综合反映鲍心跳功能在病菌胁迫下的耐受能力，从而评价鲍的抗病性；CBTB数值越大，代表鲍心跳对病菌的适应能力越强；CZTB数值越大，代表鲍在病
菌胁迫状态下抵御心率下降的能力越强。
[0015]优选的，步骤一中，待检测鲍的壳长不小于2.0cm；驯化条件包括：温度20
‑
25℃，盐度30
‑
33psu，pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，待检测鲍在室内可控的驯化条件下进行7
‑
14天的驯养，使其适应实验室环境；步骤二，测评前连接好鲍心跳检测装置；步骤三，清理鲍壳表面的附着物，擦去水分；打开鲍心跳检测装置的Powerlab信号接收仪及电脑的电源，设置电脑内的LabChart软件处于信号获取状态，将鲍心跳检测装置的红外探头抵紧鲍心脏位置的鲍壳表面，同时观察LabChart软件中检测到的心跳波形状态，微调红外探头位置使心跳波形规律、清晰；然后使用强力粘合胶水，将红外探头粘贴在相应的壳表面位置；步骤四，将粘贴好探头的鲍放入暂养槽，在20
‑
25℃下进行2
‑
4小时的暂养，使其适应检测环境；步骤五，由实验鲍的上足位置进行50
‑
100uL的鲍源致病菌注射；步骤六，在病菌胁迫过程中，使用LabChart软件实时记录鲍心跳信号，直至所有实验鲍的心跳停止正常跳动后结束记录，采集结束后对鲍心率进行统计分析；步骤七，根据鲍在病菌胁迫过程的心跳规律，定义鲍心率开始下降时减去病菌注射时间的拐点时间为鲍病菌胁迫心率拐点，鲍心率下降至零点的时间为病菌胁迫心率归零点；结合CBTB和CZTB两个指标，综合反映鲍心跳功能在病菌胁迫下的耐受能力，从而评价鲍的抗病性；所述CBTB数值越大，代表鲍心跳对病菌的适应能力越强；所述CZTB数值越大，代表鲍在病菌胁迫状态下抵御心率下降的能力越强。2.根据权利要求1所述的一种基于红外心跳检测的鲍抗病性测评方法，其特征在于：所述步骤一中，所述待检测鲍的壳长不小于2.0cm；所述驯化条件包括：温度20
‑
25℃，盐度30
‑
33psu，pH 7...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁爽，柯才焕，陈泽坤，骆轩，黄慧，沈雅威，陈楠，黄妙琴，游伟伟，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：