【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】病毒检测
[0001]本专利技术涉及用于检测和区分样品中的甲型流感病毒和乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法,以及含有所述试剂盒和用于所述方法的装置。
技术介绍
[0002]流感是呼吸道的传染性病毒感染。甲型流感是人类最常见的流感病毒类型,主要导致季节性流感流行,偶尔也会导致大流行。乙型流感病毒是不太常见的流行病原因。呼吸道合胞病毒(RSV)由两种毒株(A亚组和B亚组)组成,也是主要影响婴儿和老年人的传染病的原因。RSV的主要季节与流感季节重叠。使用分子诊断方法来识别感染流感和RSV的患者,有利于流行病和大流行病的有效控制、适当治疗选择和预防。
[0003]基于聚合酶的核酸序列扩增方法广泛用于分子诊断领域。最成熟的方法,聚合酶链反应(PCR),通常涉及每个靶序列使用两个引物,在循环指数扩增过程中通过温度循环实现引物退火、DNA聚合酶延伸和新合成的DNA的变性。温度循环需要复杂设备进行,这限制了基于PCR的方法在某些应用中的使用。
[0004]链置换扩增(SDA)(EP0497272;US5455166;US5712124)被开发出来,作为替代PCR的一种等温方法,该方法无需温度循环在聚合酶扩增过程中实现双链DNA的退火和变性,而是用限制酶与链置换聚合酶的组合来分开两条DNA链。
[0005]在SDA中,在存在一种或多种α
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巯基核苷酸的情况下,位于每个引物5'端的限制酶位点被引入扩增产物中,并且凭借限制酶仅切割其识别位点的半硫代磷酸酯形式的未修饰链的能力,用限制酶 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒,其中,分别针对每种病原体,所述试剂盒包含以下组分:h)引物对,所述引物对包含:iii.第一寡核苷酸引物,其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域,和iv.第二寡核苷酸引物,其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域;所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基;i)限制酶,所述限制酶不是切口酶,其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点;j)探针对,所述探针对包含:iii.具有杂交区域的第一寡核苷酸探针,其中所述杂交区域能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交,并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上;和iv.具有杂交区域的第二寡核苷酸探针,其中所述杂交区域能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中位于第一单链检测序列的上游或下游的第二单链检测序列杂交,并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上;其中,至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在其杂交区域的3
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端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸,且不能被限制酶在所述杂交区域中切割;且所述试剂盒还包含:k)逆转录酶;l)链置换DNA聚合酶;m)dNTP;和n)一种或多种修饰的dNTP。2.权利要求1的试剂盒,其中甲型流感和/或乙型流感病毒来源RNA中的第一和第二杂交序列位于或源自所述流感病毒基因组的区段1、2、3、5、7或8之一中。3.权利要求1或2的试剂盒,用于检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒,所述试剂盒还包含用于病原体呼吸道合胞病毒的组分a)、b)和c)。4.权利要求3的试剂盒,其使用相同的引物对和探针对,检测呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B。5.权利要求4的试剂盒,其中呼吸道合胞病毒来源RNA中的第一和第二杂交序列位于或源自呼吸道合胞病毒A和B的NS2(非结构蛋白2)、N(核蛋白)、F(融合糖蛋白)、M(基质蛋白)或L(聚合酶)基因之一中。6.前述权利要求任一的试剂盒,其中每种病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一都在其杂交区域的3
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端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸,并且不能被该限制酶在所述杂交区域中切割。7.前述权利要求任一的试剂盒,其中由于存在一个或多个序列错配和/或一个或多个修饰如硫代磷酸酯键,使得该封闭的寡核苷酸探针不能被限制酶切割。8.前述权利要求任一的试剂盒,其中该封闭的寡核苷酸探针包含附加区域,使得与该
封闭寡核苷酸探针杂交的扩增产物内的该分子的3'端可通过链置换DNA聚合酶延伸。9.前述权利要求任一的试剂盒,其中病原体的(一种或多种)封闭寡核苷酸探针与用于该病原体的引物对和/或限制酶混合提供。10.前述权利要求任一的试剂盒,其中用于病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针都在其杂交区域的3
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端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸,且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。11.前述权利要求任一的试剂盒,其中至少一种病原体的第一和第二寡核苷酸探针之一的杂交区域具有与该病原体的第一或第二引物之一的杂交区域或该杂交区域的反向互补序列互补的5个或更多个碱基。12.权利要求11的试剂盒,其中第一寡核苷酸探针的杂交区域具有与第一和第二寡核苷酸引物之一的杂交区域互补的5个或更多个碱基,且第二寡核苷酸探针的杂交区域具有与第一和第二寡核苷酸引物之另一的杂交区域的反向互补序列互补的5个或更多个碱基。13.前述权利要求任一的试剂盒,其中一种或多种修饰的dNTP是α
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巯基修饰的dNTP。14.前述权利要求任一的试剂盒,其中用于每种病原体的限制酶是相同的。15.前述权利要求任一的试剂盒,其中允许第一寡核苷酸探针检测的部分是比色或荧光染料、或能够连接到比色或荧光染料的部分,例如生物素。16.前述权利要求任一的试剂盒,其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是单链寡核苷酸,所述单链寡核苷酸对于每种病原体是不同的。17.权利要求16的试剂盒,其中单链寡核苷酸部分的序列包含2至4个碱基DNA序列基序的三个或更多个重复拷贝。18.前述权利要求任一的试剂盒,其中第一和/或第二寡核苷酸引物包含位于限制酶识别序列和切割位点上游的稳定化序列,所述稳定化序列的长度为例如5或6个碱基。19.前述权利要求任一的试剂盒,其中寡核苷酸引物的杂交区域长度为9
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16个碱基。20.前述权利要求任一的试剂盒,其中病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列相隔0至15个碱基或3至20个碱基,例如3至15个碱基。21.前述权利要求任一的试剂盒,其中扩增产物中的该至少一个分子中的第一或第二单链检测序列包括与权利要求20中所定义碱基相应的序列中的至少3个碱基。22.前述权利要求任一的试剂盒,还包括用于实施过程控制的组分,例如:b)引物对,所述引物对包含:iii.第一寡核苷酸引物,其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中的第一杂交序列杂交的区域,和iv.第二寡核苷酸引物,其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域;所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基;d)限制酶,所述限制酶不是切口酶,其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点;e)探针对,所述探针对包含:iii.第一寡核苷酸探针,其能够与对照核酸存在时产生的扩增产物中的至少一个分子的第一单链检测序列杂交,并且所述探针连接在允许所述探针检测的部分上;和
iv.第二寡核苷酸探针,其能够与扩增产物中的该至少一个分子中的第一单链检测序列上游或下游的第二单链检测序列杂交,并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接于固体材料的部分上。23.权利要求22的试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员:H,
申请(专利权)人:圣斯生物检测有限公司,
类型:发明
国别省市:
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