PD1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，本发明专利技术公开了一种PD1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途，本发明专利技术通过细胞试验和动物试验发现PD1抑制剂可降低心肌梗死后成心脏纤维细胞的转分化水平。不仅为心肌梗死提供了一种治疗药物或者治疗策略，同时也为心脏成纤维细胞的转分化研究提供了一种工具药。转分化研究提供了一种工具药。转分化研究提供了一种工具药。

【技术实现步骤摘要】
PD1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及PD1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途。

技术介绍

[0002]心肌梗死是一种严重威胁人类健康的常见的心血管疾病，尽管近年来随着医疗技术水平的提高许多急性心肌梗死患者得以生存，但心肌梗死后心肌重构可以导致心力衰竭，严重心力衰竭是患者死亡最主要原因。心肌梗死后各个时相都有着其特征性病理生理改变，其梗死过程由多种细胞相互作用并共同参与，包括早期心肌细胞大量死亡，免疫细胞浸润，同时伴有血管新生，成纤维细胞激活，心肌代偿肥厚以及慢性病理性心肌重构等一系列病理生理过程。近年来一系列研究表明：心肌梗死导致心肌慢性重构过程中，免疫细胞参与了整个过程，利用免疫细胞调控血管新生以及成纤维细胞活化是改善心肌梗死预后的重要靶点。
[0003]PD1/PD
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L1作为T细胞抗原TCR以外的第二刺激信号通路，阻断PD1信号活性具有重新激活被耗竭的T细胞的生物活性并发挥其免疫活性的功能，这也是当今肿瘤治疗的研究热点。然而PD1/PD
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L1信号通路在非肿瘤病变中对免疫细胞功能的调控机制却并不明了。
[0004]此外，在不同种类的疾病以及不同组织器官中PD1抑制剂的生物效应有明显的差异。例如，在神经系统中，PD1抑制剂可削弱吗啡的镇痛效果；而在运用于治疗肿瘤的过程中，PD1抑制剂可引起神系统的副作用，主要是神经肌肉病变；在阿尔茨海默病方面，有研究表明，PD1信号通路阻滞可改善该症状；这说明了在不同疾病、不同器官中，PD1抑制剂最终发挥的作用是具有显著差异的，并没有明显的相通性。在现有的报道中，尚鲜有关于将PD1抑制剂应用于心脏类疾病中的报道。在心肌梗死中，心脏成纤维细胞过度纤维化(过度转分化)可恶化心功能。因此对于与心脏成纤维细胞过度纤维化相关的疾病而言，寻求可抑制心脏成纤维细胞转分化的药物是一种潜在有效的治疗途径。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种PD1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途。本专利技术通过细胞试验和动物试验发现PD1抑制剂可降低心肌梗死后成心脏纤维细胞的转分化水平。不仅为心肌梗死提供了一种治疗药物或者治疗策略，同时也为心脏成纤维细胞的转分化研究提供了一种工具药。
[0006]本专利技术的具体技术方案为：本专利技术提供了一种PD1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途。
[0007]作为优选，所述心脏成纤维细胞转分化抑制剂为用于科学研究的工具药，或者是用于治疗心肌梗死的药物。
[0008]作为优选，PD1抑制剂选自纳武单抗、帕博利珠单抗和T药（Tecentrip）。
[0009]进一步优选，所述PD1抑制剂为纳武单抗。
BIOLEGEND公司)，避光常温孵育20分钟，1500rpm离心5 分钟去除抗体，添加PBS缓冲液离心洗涤2 次，最后添加 500μl PBS缓冲液重悬后进行流式细胞仪(美国BD公司) 分选。
[0027]（4）分选后的T细胞分别与乳鼠心脏成纤维细胞共培养，将T细胞置于Tran'swell( 美国 Costar 公司，孔径为 0.4μm)的上室，浓度为2*105/ml，培养基为1640培养基。同时在tran
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swell的上室上清中10ug/ml 的PD1抑制剂(BIoX cell)，处理48小时，乳鼠心脏成纤维细胞放于transwell板的下室。
[0028]（5）共培养48小时后利用收集下室的乳鼠心脏成纤维细胞生长，通过Western Blot检测乳鼠心脏成纤维的转分化水平。
[0029]结果见图1所示：PD1+T细胞较PD1
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T细胞能明显促进乳鼠心脏成纤维细胞转分化蛋白Collagen 3 、Periostin、Asma的高表达，PD1抑制剂能够抑制PD1+T引起的乳鼠心脏成纤维细胞转分化；因此PD1+T细胞较能够促进乳鼠心脏成纤维细胞转分化。
[0030]实施例2（小鼠体内实验）（1）治疗小鼠心肌梗死后的模型用药包括：建立心肌梗死模型提前24小时给予腹腔注射400ug/20g的PD1抑制剂(BIoX cell)，并对小鼠前胸进行脱毛备皮。建立心肌梗死模型，将小鼠用4%戊巴比妥（10mg/0.8ml）麻醉，待其处于麻醉状态后固定于鼠板上，然后使用气管插管，并连接呼吸机。调整呼吸机频率为98次/分，潮气量为1.2
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1.5ml。用剪刀剪开小鼠左侧胸廓表面皮肤，使用镊子钝性分离胸前肌肉，用剪刀沿左侧3
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4肋剪开，然后使用小动物胸撑逐步撑开肋骨，充分暴露心脏。撕开心包，可见左冠状动脉前降支走行于左心耳与肺动脉圆锥交界处。使用7
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0 prolene线在左心耳下2mm处结扎前降支。心肌梗死模型成功建立后，分别每间隔3天通过腹腔注射给与PD1抑制剂(BIoX cell)，总疗程时间28天。并且在心肌梗死术后3天，7天，14天，28天，通过心脏超声检测心功能。
[0031]（2）心梗术后28天后，将小鼠使用4%戊巴比妥（10mg/0.8ml）麻醉，固定在鼠板上。开腹，暴露下腔静脉，静脉注射5mg/ml 氯化钾100ul，使心脏停跳在舒张期。开胸，使用棉签轻轻剥离梗死处与肋骨粘合的心脏。用剪刀将心脏右心耳剪开。用1ml注射器将 PBS缓冲液从左心室心尖注入小鼠心脏进行灌流，直到小鼠肝脏和肺脏颜色变白为止。沿主动脉根部取出心脏。放入30%蔗糖包埋，做组织冰冻病理切片用。病理切片马松染色后用使用体式显微镜拍照来评估心脏梗死面积。使用Imagepro plus 软件画出蓝色和红色的内膜和外膜长度。心肌梗死面积为：（心梗内膜+外膜）/（总内膜+外膜）。每个心脏取4个section进行统计。
[0032]如图2所示，回输PD1+T能够明显增加心脏的梗死面积，并且使心功能恶化；图3显示：建立心肌梗死模型后，给予PD1抑制剂治疗后能够改善心脏的收缩功能；图4显示建立心肌梗死模型后，给予PD1抑制剂治疗后，减少心肌梗死的面积，同时能够减少心肌梗死后心脏远端区的纤维化，这说明PD1抑制剂能够抑制心肌梗死炎症反应和心肌梗死后心脏纤维化；机制探讨方面如图5所示；通过分选PD1+T和PD1
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T细胞进行炎症因子测序，发现PD1+T细胞高表达促成纤维细胞转分化的分子MIG；进一步通过用MIG抑制CXCR3来阻滞MIG的功能，发现阻滞了PD1+T分泌的炎症因子能够明显改善成纤维细胞的转分化水平，这说明PD1抑制剂能够通过抑制炎症因子分泌进一步抑制心脏成纤维细胞转分化。
[0033]实施例3（食蟹猴体内试验）（1）食蟹猴心肌梗死模型建立：食蟹猴备皮，诱导麻醉后将其仰卧位固定于操作台上，随后气管插管，连接呼吸机辅助通气。手术野皮肤以碘伏消毒后，逐层开胸，于第3肋间
隙进胸去心包后暴露心脏，用6
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0尼龙线永久结扎冠状动脉前降支，可见结扎线以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PD1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述心脏成纤维细胞转分化抑制剂为用于科学研究的工具药，或者是用于治疗心肌梗死的药物。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述PD1抑制剂为纳武单抗、帕博利珠单抗或T药。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述PD...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡新央，王建安，陈晓英，柯昌乐，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：