一种FYCO1-ALK融合基因及其检测试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种非小细胞肺癌FYCO1

【技术实现步骤摘要】
一种FYCO1
‑
ALK融合基因及其检测试剂盒和应用


[0001]本专利技术涉及一种非小细胞肺癌FYCO1
‑
ALK融合基因及其检测试剂盒和应用，属于生物医学检测领域。

技术介绍

[0002]肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(Non
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Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的一个类型，大约有50%的NSCLC存在靶向药物相关的基因突变，最为常见的是表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）基因18号外显子的点突变和19号外显子的缺失突变以及间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase，ALK)基因的融合突变。靶向药物具有副作用小、效果好的特性，可显著提高患者生存质量和生存期，尤其是ALK基因融合突变的患者，服用靶向药物后其疾病的无进展生存期（progression
‑
free surviva，PFS）可达3
‑
5年。因此如何快速、准确的检测出ALK基因融合突变，对于患者的治疗和生存显得十分重要。
[0003]ALK基因表达的蛋白位于细胞膜上，分为胞外受体区、跨膜区以及胞内激酶区，正常情况下经细胞外的配体将2个ALK蛋白偶联后激活胞内信号通路，促进细胞生长。当ALK基因发生融合后，无需配体，ALK蛋白胞内酪氨酸激酶可自行激活，导致该结构域的蛋白异常表达，引起ALK及其下游信号传导通路活化，进而促使细胞增殖不受控制形成肿瘤。ALK基因80%的融合伴侣基因为EML4，近些年通过二代测序技术不断发现了新的融合基因KIF5B、TGF、KLC1、PTPN3、STRN等。
[0004]FYCO1 基因位于3号染色体上，长度为79kb包含18个外显子，编码1478个氨基酸，编码FYCO1蛋白相对分子质量为167 000 Da，在多种组织中均有表达，研究表明FYCO1基因突变是导致常染色体隐性遗传性白内障的主要原因。
[0005]通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)及反转录聚合酶链反应(RT
‑
PCR)等常规检测方法，可以实现ALK基因部分融合突变类型的检测。但是IHC检测方法，特异性较差；FISH方法检测ALK，灵敏度较低；RT
‑
PCR仅能检测已知的ALK融合基因。目前高通量测序是唯一可以明确未知融合突变的检测方法，但是该技术本高、费用昂贵、检测周期长，对于设备和实验室的面积要求苛刻，目前只有少数大型综合医院开展，对于大多数患者来说不是首选的检测方法。
[0006]针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，利用荧光定量PCR技术，是检测基因融合突变最便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物及探针将有利于提高肺癌ALK基因融合突变的检测范围和水平，让更多的患者受益。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种非小细胞肺癌的新的融合基因FYCO1
‑
ALK。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供融合基因FYCO1
‑
ALK在治疗非小细胞肺癌中的应用。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种检测FYCO1
‑
ALK融合基因的检测试剂盒。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种FYCO1
‑
ALK融合基因， ALK基因的融合伴侣基因为FYCO1基因，基因融合突变发生于FYCO1基因的12号外显子与ALK基因的20号外显子之间；FYCO1
‑
ALK融合基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]所述FYCO1基因位于3号染色体3p21.31上，位置45917903
‑
45995824，共23个外显子。
[0012]所述ALK基因位于2号染色体2p23.2
‑
p23.1上，位置29190992
‑
29921589，共29个外显子。
[0013]一种检测所述FYCO1
‑
ALK融合基因的组合物，包括FYCO1
‑
ALK融合基因、内参HPRT1基因的上游引物、下游引物和探针序列，具体如下：上游引物FYCO1
‑
E12
‑
F：AAGCGGGAGTTCAGCTGGATGG；(SEQ ID NO.2)；下游引物ALK
‑
E20
‑
R ：CTCCATCTGCATGGCTTGCAGC (SEQ ID NO.3)；探针FYCO1
‑
ALK
‑
Probe：FAM
‑5‑
CCGGAAGCACCAGGA
‑3‑
MGB(SEQ ID NO.4)；上游引物HPRT1
‑
F：5
‑
CAGGCAGTATAATCCAAAGATGGTCA
‑
3(SEQ ID NO.5)；下游引物HPRT1
‑
R：5
‑
GTCTGGCTTATATCCAACACTTCGT
‑
3(SEQ ID NO.6)；探针HPRT1
‑ꢀ
Probe：VIC
‑5‑
TCACCAGCAAGCTT
‑3‑
MGB(SEQ ID NO.7)。
[0014]一种检测所述FYCO1
‑
ALK融合基因的试剂盒，包括如下成份：PCR反应液
①
：所述组合物、镁离子、dNTP、去离子水；PCR反应液
②
：PCR buffer；PCR混合酶：Tap酶、逆转录酶、UDG酶；阳性对照：FYCO1
‑
ALK融合基因的质粒、HPRT1基因的质粒；阴性对照：去离子水。
[0015]一种以非诊断和治疗目的检测FYCO1
‑
ALK融合基因的方法，包括以下步骤：（1）提取待测样本RNA；（2）使用所述试剂盒，进行荧光定量PCR反应；（3）根据PCR扩增结果，判断检测结果。
[0016]所述荧光定量PCR的反应体系为： PCR反应液
①
：各引物和探针的浓度均为10 pmol，上游引物共1.0μL、下游引物共1.0μL、探针共0.7μL，25mM镁离子0.5μL，25mM dNTP0.3μL，去离子水30.5μL，共34μL；PCR反应液
②
：5X PCR buffer 10μL；PCR混合酶：5U/μL Tap酶0.5μL、5U/μL逆转录酶0.2μL、5U/μL UDG酶0.3μL，共1μL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FYCO1
‑
ALK融合基因，其特征在于，ALK基因的融合伴侣基因为FYCO1基因，基因融合突变发生于FYCO1基因的12号外显子与ALK基因的20号外显子之间；FYCO1
‑
ALK融合基因的序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的FYCO1
‑
ALK融合基因，其特征在于，所述FYCO1基因位于3号染色体3p21.31上，位置45917903
‑
45995824，共23个外显子。3.如权利要求1所述的FYCO1
‑
ALK融合基因，其特征在于，所述ALK基因位于2号染色体2p23.2
‑
p23.1上，位置29190992
‑
29921589，共29个外显子。4.一种检测权利要求1所述FYCO1
‑
ALK融合基因的组合物，其特征在于，包括FYCO1
‑
ALK融合基因、内参HPRT1基因的上游引物、下游引物和探针序列，具体如下：上游引物FYCO1
‑
E12
‑
F：AAGCGGGAGTTCAGCTGGATGG；(SEQ ID NO.2)；下游引物ALK
‑
E20
‑
R ：CTCCATCTGCATGGCTTGCAGC (SEQ ID NO.3)；探针FYCO1
‑
ALK
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Probe：FAM
‑5‑
CCGGAAGCACCAGGA
‑3‑
MGB(SEQ ID NO.4)；上游引物HPRT1
‑
F：5
‑
CAGGCAGTATAATCCAAAGATGGTCA
‑
3(SEQ ID NO.5)；下游引物HPRT1
‑
R：5
‑
GTCTGGCTTATATCCAACACTTCGT
‑
3(SEQ ID NO.6)；探针HPRT1
‑ꢀ
Probe：VIC
‑5‑
TCACCAGCAAGCTT
‑3‑
MGB(SEQ ID NO.7)。5.一种检测权利要求4所述FYCO1
‑
ALK融合基因的试剂盒，其特征在于，包括如下成份：PCR反应液
①
：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，冯煜舒，高亚岚，
申请(专利权)人：郑州大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：