人造血干细胞和祖细胞中α-珠蛋白基因座处的靶向整合制造技术

本公开内容提供了特别是通过用编码治疗性蛋白的转基因替换造血干细胞和祖细胞(HSPC)中的HBA1或HBA2基因座，对所述HSPC进行遗传修饰的方法和组合物。遗传修饰的方法和组合物。遗传修饰的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人造血干细胞和祖细胞中
α
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珠蛋白基因座处的靶向整合
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2019年11月15日提交的美国临时专利申请第62/936,248号的优先权，该申请通过引用以其整体并入本文。关于在联邦资助的研究和开发下作出的专利技术权利的声明
[0002]本专利技术是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)给予的第HL135607号基金的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。背景
[0003]β
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地中海贫血是世界上最常见的遗传性血液病症之一，全球发病率为1/100,000(1)。患有这种疾病的患者遭受了严重的贫血，并且即使接受重症监护，中位预期寿命也只有30岁(2
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4)。该疾病最严重形式—重型β地中海贫血—是由整个β
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珠蛋白(HBB)基因的纯合(或复合杂合)功能丧失突变引起的。这会导致HBB蛋白损失，导致严重的贫血并降低红血细胞(RBC)向全身输送氧气的能力。未配对的α
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珠蛋白(来自HBA1和HBA2基因)的积累会导致显著的红细胞毒性，导致患者中出现贫血。事实上，已知疾病严重程度与β
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珠蛋白和α
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珠蛋白链之间的不平衡程度直接相关(5)。目前对β
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地中海贫血的护理标准包括频繁输血结合铁螯合疗法，使其成为年轻人中最昂贵的遗传病之一(6)。目前，这种疾病的唯一治愈策略是来自免疫匹配供体的同种异体造血干细胞移植(HSCT)。然而，在大多数情况下，没有匹配的供体可用于同种异体HSCT，并且即使确定了一名供体，来自这些供体的移植物也存在免疫排斥和移植物抗宿主病的风险(7)。
[0004]一种潜在的理想治疗包括分离患者来源的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，引入HBB以恢复HBB蛋白水平，然后对患者自身校正的HSPC进行自体HSCT，这不会带来免疫排斥的风险。采用这种逻辑，已经开发了几种基因疗法作为β
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地中海贫血的潜在治愈措施，主要是通过使用慢病毒载体递送HBB转基因进行(8，9)。虽然这些方法已经显示在β
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地中海贫血的人类临床试验中将HBB恢复到治疗水平(10)，但使用慢病毒和逆转录病毒载体进行递送导致半随机基因组整合，这能够使肿瘤抑制基因失活或激活癌基因。事实上，HSPC中的半随机整合已经显示导致克隆扩增、骨髓发育不良和急性髓样白血病(11
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14)，其中一个实例被证明是致命的(15)。此外，慢病毒基因治疗方法虽然达到了对较轻形式的输血依赖性β
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地中海贫血的注册状态(registration status)，但并未导致严重形式的疾病的输血独立性。
[0005]由于这些剩余的安全性和功效问题，已经开发了替代策略，其采用基因组编辑(包括锌指核酸酶和CRISPR/Cas9系统)来启动位点特异性DNA双链断裂(DSB)以使胎儿血红蛋白的阻遏物失活，胎儿血红蛋白的上调可以弥补HBB的缺乏(16)。然而，有人担心由此产生的胎儿血红蛋白上调可能不足以挽救β
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珠蛋白:α
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珠蛋白失衡，以及在胎儿血红蛋白自然沉默的成年患者中，这种上调可能不会持续存在(17，18)。而且，这种方法没有解决β
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地中海贫血的遗传原因—HBB失活—并且可能无法在体内充分挽救疾病表型。此外，所有这些疗法仅用于弥补HBB的缺乏，并不会降低α
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珠蛋白的水平。
[0006]因此，需要新的、安全且有效的方法以在体内或离体将HBB或其他治疗性转基因引入自体HSPC和红血细胞中。本公开内容满足了这种需要并且还提供了其他优势。
概述
[0007]在一方面，本公开内容提供了遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述整合的转基因导致所述蛋白质在所述遗传修饰的HSPC中表达。
[0008]在另一方面，本公开内容提供了遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述引入导致与所述RNA引导的核酸酶、所述供体模板以及与HBA1基因序列和HBA2基因序列杂交的引导RNA的引入相比所述HSPC的基因组中易位事件减少。
[0009]在另一方面，本公开内容提供了遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述引入导致与所述RNA引导的核酸酶、所述供体模板以及与HBA1基因序列和HBA2基因序列杂交的引导RNA的引入相比所述HSPC的基因组中供体模板的脱靶整合减少。
[0010]在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，所述方法还包括在引入所述引导RNA、所述RNA引导的核酸酶和所述供体模板之前从所述对象分离所述HSPC。在一些实施方案中，HBA1基因序列或BA2基因序列包含3
’
UTR区。在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶切割HBA1基因序列但不切割HBA2基因序列。在一些实施方案中，HBA1基因序列包含SEQ ID NO:5的序列。在一些实施方案中，将转基因整合至HBA1基因序列中。在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶切割HBA2基因序列但不切割HBA1基因序列。在一些实施方案中，HBA2基因序列包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，将转基因整合至HBA2基因序列中。
[0011]在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，HSPC包含与野生型HBB基因相比包含突变的HBB基因。在一些实施方案中，突变是疾病的病因。在一些实施方案中，疾病是β
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括：将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述整合的转基因导致所述蛋白质在所述遗传修饰的HSPC中表达。2.遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括：将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述引入导致与所述RNA引导的核酸酶、所述供体模板以及与HBA1基因序列和HBA2基因序列杂交的引导RNA的引入相比所述HSPC的基因组中易位事件减少。3.遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括：将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述引入导致与所述RNA引导的核酸酶、所述供体模板以及与HBA1基因序列和HBA2基因序列杂交的引导RNA的引入相比所述HSPC的基因组中供体模板的脱靶整合减少。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在引入所述引导RNA、所述RNA引导的核酸酶和所述供体模板之前从所述对象分离所述HSPC。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列包含3
’
UTR区。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶切割所述HBA1基因序列但不切割所述HBA2基因序列。7.如权利要求6所述的方法，其中所述HBA1基因序列包含SEQ ID NO:5的序列。8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述转基因整合至所述HBA1基因序列中。9.如权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶切割所述HBA2基因序列但不切割所述HBA1基因序列。10.如权利要求9所述的方法，其中所述HBA2基因序列包含SEQ ID NO:2的序列。11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述转基因整合至所述HBA2基因序列中。12.如权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述HSPC包含与野生型HBB基因相比包含突变的HBB基因。13.如权利要求12所述的方法，其中所述突变是疾病的病因。14.如权利要求13所述的方法，其中所述疾病是β
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地中海贫血。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述转基因选自：HBB、PDGFB、IDUA、FIX(Padua变体)、LDLR和PAH。16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述转基因是HBB。17.如权利要求16所述的方法，其中所述HBB在所述HSPC中表达并且与引入所述引导RNA、所述RNA引导的核酸酶和所述供体模板之前相比，所述HBB提高了所述HSPC中成人血红蛋白四聚体的水平。18.如权利要求16所述的方法，其中所述转基因是HBB，其中所述引导RNA与SEQ ID NO:5的序列杂交，并且其中所述HBB整合在所述HBA1基因序列的位点处。19.如权利要求15所述的方法，其中所述对象患有β
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地中海贫血，并且其中将表达所述HBB转基因的遗传修饰的HSPC重新引入所述对象中。20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述整合的转基因的表达由内源性HBA1或HBA2启动子驱动。21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述整合的转基因替换所述HSPC的基因组中的HBA1或HBA2编码序列。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述整合的转基因替换所述HSPC的基因组中的HBA1或HBA2开放阅读框(ORF)。23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是分泌蛋白。24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白。25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述引导RNA包含一个或多个2
’‑
O
‑
甲基
‑3’‑
硫代磷酸(MS)修饰。26.如权利要求25所述的方法，其中所述一个或多个2
’‑
O
‑
甲基
‑3’‑
硫代磷酸(MS)修饰存在于所述引导RNA的5
’
和3
’
端的三个末端核苷酸处。27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9。28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述引导RNA和所述RNA引导的核酸酶作为核糖核蛋白(RNP)复合物通过电穿孔引入所述HSPC中。29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中使用重组腺相关病毒(rAAV)载体将所述供体模板引入所述HSPC中。30.如权利要求29所述的方法，其中所述rAAV载体是AAV6载体。31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中离体进行所述引入。32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其还包括将所述遗传修饰的HSPC引入所述对象中。33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其还包括诱导所述遗传修饰的HSPC在体外或离体分化为红血细胞(RBC)。34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述对象是人。35.引导RNA，其包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交但不同时与HBA1基因序列和HBA2基因序列杂交的序列。36.如权利要求35所述的引导RNA，其中所述引导RNA与所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列的3
’
UTR杂交。37.如权利要求35或36所述的引导RNA，其中所述引导RNA与所述HBA1基因序列杂交。
38.如权利要求37所述的引导RNA，其中所述HBA1基因序列包含SEQ ID NO:5的序列。39.如权利要求37或38所述的引导RNA，其中所述引导RNA与所述HBA2基因序列杂交。40.如权利要求39所述的引导RNA，其中所述HBA2基因序列包含SEQ ID NO:2的序列。41.如权利要求35至40中任一项所述的引导RNA，其中所述引导RNA包含一个或多个2
’‑
O
‑
甲基
‑3’‑
硫代磷酸(MS)修饰。42.如权利要求41所述的引导RNA，其中所述一个或多个2
’‑
O
‑
甲基
‑3’‑
硫代磷酸(MS)修饰存在于所述引导RNA的5
’
和3
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端的三个末端核苷酸处。43.HSPC，其包含权利要求35至42中任一项所述的引导RNA。44.遗传修饰的HSPC，其包含整合在HBA1或HBA2基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修，
申请(专利权)人：莱兰斯坦福初级大学评议会，
类型：发明
国别省市：