B细胞的大规模组合CAR转导和CRISPR基因编辑制造技术

本公开内容的实施方案涵盖用于产生工程化B细胞的方法和组合物。本公开内容涉及用于产生B细胞的大规模方法，所述B细胞可以使用CRISPR工程化以破坏一种或多种基因的表达并且还表达至少一种异源抗原受体。具体实施方案包括用于该方法的具体参数。包括用于该方法的具体参数。包括用于该方法的具体参数。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】B细胞的大规模组合CAR转导和CRISPR基因编辑
[0001]本申请要求2019年11月27日提交的美国临时专利申请序列号62/941,651的优先权，其通过引用整体并入本文。


[0002]本公开内容一般涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。

技术介绍

[0003]B细胞可大致分为效应细胞和调节细胞。效应B细胞是体液免疫的关键驱动因素，因为它们能够产生对病原体具有特异性的抗体。最近已显示调节性B细胞通过产生抗炎细胞因子(包括IL
‑
10、IL
‑
35和TGF
‑
β)来控制多种疾病的炎症反应。这些B细胞亚群对免疫调节和体液免疫的重要影响使它们成为各种免疫疾病的有价值的细胞疗法候选者。因此，对改进的B细胞免疫治疗方法的需求尚未得到满足。B细胞离体扩增的挑战及其在培养中经历细胞凋亡的趋势是限制其治疗潜力的主要因素。创建具有卓越活力的成功扩增方案将为B细胞直接用于治疗或作为体外抗体生产的来源打开大门。此外，改造B细胞的策略可以进一步增加其在治疗中的效用。因此，对于改进的特别是使用B细胞的细胞免疫治疗方法存在未满足的需求。

技术实现思路

[0004]本公开内容的实施方案包括与未经如此工程化的B细胞相比增强经专门工程化以具有此类活性的B细胞的活力和持久性的方法和组合物。具体实施方案包括与未经如此工程化的B细胞相比减少经专门工程化以降低细胞凋亡的风险的B细胞的凋亡的方法和组合物。本公开内容的方法利用特定参数来改善B细胞的扩增并提高它们的功效以用作有需要的个体的疗法。
[0005]本公开内容的实施方案包括用于扩增B细胞的新型大规模方法(包括GMP级)，包括使用或不使用CAR转导和/或基因编辑，包括CRISPR基因编辑。本公开内容提供了表达一种或多种异源抗原受体和/或已被基因编辑以破坏B细胞中的一种或多种内源基因的工程化B细胞。在一些实施方案中，CAR转导的B细胞被工程化以破坏B细胞中一种或多种内源基因的表达，并且在其他实施方案中，具有破坏B细胞中一种或多种内源基因的表达的B细胞被转导或转染以表达一种或多种异源抗原受体。特定实施方案提供了大规模CRISPR/Cas9介导的原代CAR转导的B细胞的工程化策略。
[0006]在某些实施方案中，所述方法利用允许该方法大规模进行(包括用于工程化高达1x109、1x10
10
、1x10
11
个或更多个细胞)的特定参数，包括条件和/或试剂。在特定情况下，所述方法利用连续步骤，包括一个或多个扩增步骤，以及细胞修饰以增强B细胞的增殖，如下：(1)携带一种或多种异源抗原受体；(2)缺乏B细胞中一种或多种内源基因的表达或表达减少；和/或(3)表达一种或多种细胞因子基因。B细胞关于(1)、(2)和(3)的修饰可以以任何顺序进行。在一些情况下，(1)、(2)和(3)中的一项或多项是任选的并且可以不使用。在特定情
况下，使用针对多个基因的CRISPR和指导RNA敲除或敲低一个或多个内源基因。产生所需B细胞的方法还包括该方法的特定步骤的特定持续时间，包括该方法的一个或多个特定步骤。
[0007]产生的工程化B细胞可用于任何目的，包括用于治疗医学病况，例如癌症、传染病和/或免疫相关病症。在一些实施方案中，在使用前适当地储存B细胞。就细胞来源而言，工程化B细胞的接受者个体可以是自体的或同种异体的。在一些情况下，在适当储存之后，通过本公开内容的方法产生的B细胞用于治疗目的并且在储存产生之后可以或可以不被进一步修饰。例如，可以对B细胞进行工程化以对细胞中的一种或多种内源基因进行基因编辑以促进它们的活力，然后储存B细胞，但在使用之前，可以进一步修饰B细胞，以表达特定于接受者个体需求的异源抗原受体，例如靶向个体癌细胞上的抗原的受体。在其他情况下，可以对B细胞进行工程化以表达异源抗原受体，包括例如针对已知癌症抗原的抗原，然后储存B细胞，但在使用之前，可以进一步修饰B细胞，进行基因编辑以破坏一种或多种内源基因的表达。在这个例子中，异源抗原受体可以设计为或不设计为靶向众所周知的癌症抗原，或存在于多种癌症细胞类型上的抗原。
[0008]在特定实施方案中，异源抗原受体是嵌合抗原受体或T细胞受体。异源抗原受体可以靶向肿瘤相关抗原。在特定情况下，异源抗原受体靶向选自以下的抗原：CD19、CD319(CS1)、ROR1、CD20、CD70、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA
‑
125、MUC
‑
1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变型p53、突变型ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV
‑
1包膜糖蛋白gp120、HIV
‑
1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD5、CD123、CD23、CD30、CD56、c
‑
Met、间皮素、GD3、HERV
‑
K、IL
‑
11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT
‑
1、TRAIL/DR4、VEGFR2、CD33、CD47、CLL
‑
1、U5snRNP200、CD200、BAFF
‑
R、BCMA、CD99及其组合。其他抗原在本文别处列出。
[0009]在特定实施方案中，在B细胞中表达破坏的内源基因是抑制基因。在特定情况下，在B细胞中表达破坏的内源基因是NKG2A、SIGLEC
‑
7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL
‑
1、PDL
‑
2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、TDAG8、CD5、CD7、SLAMF7、CD38、LAG3、TCR、β2
‑
微球蛋白、HLA、CD73、CD39或它们的组合。
[0010]在特定实施方案中，B细胞是基因编辑的，其中一种或多种组合物通过电穿孔递送至B细胞。在其中电穿孔B细胞的情况下，电穿孔可以利用特定量的B细胞，例如约200,000个细胞至1x10
11
个B细胞。电穿孔可使用约200,000至2,000,000个细胞。在特定情况下，电穿孔可使用约1,000,000至1x109或更多(10
10
、10
11
)个B细胞，以及其中可推导出的任何范围。
[0011]在本文的任何方法中，可以分析任何工程化B细胞，包括通过基因编辑的功效、功能测定、细胞毒性测定和/或体内活性来分析的细胞。在具体实施方案中，通过流式细胞术、质谱流式细胞术、RNA测序、PCR或其组合分析所述细胞。可以储存任何所述细胞，例如冷冻保存，包括在所述方法中的特定步骤之后或在产生最终细胞产物之后。可以将有效量的B细胞递送至有需要的个体，例如患有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生工程化B细胞的体外方法，其包括以下步骤：(a)刺激从外周血单核细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、永生化B细胞系、B细胞杂交瘤、骨髓和/或脐带血单核细胞获得的B细胞持续第一时间段，所述刺激包括暴露于一种或多种适当的细胞因子，从而产生经刺激的B细胞；(b)用CD40配体转导所述经刺激的B细胞以产生CD40L阳性B细胞，并且数字地扩增所述CD40L阳性B细胞持续第二时间段；和(c1)和(d1)或(c2)和(d2)之一：(c1)向扩增的CD40L阳性B细胞递送有效量的Cas9或CpF1和一种或多种指导RNA，以破坏B细胞中一种或多种基因的表达，从而产生基因编辑的B细胞；和(d1)用编码异源抗原受体的载体转导或转染(c1)的基因编辑的B细胞，以产生经修饰的基因编辑的B细胞；或者(c2)用编码异源抗原受体的载体转导或转染扩增的CD40L阳性B细胞，以产生经修饰的B细胞；和(d2)向所述经修饰的B细胞递送有效量的Cas9或CpF1和一种或多种指导RNA，以破坏B细胞中一种或多种基因的表达，从而产生经修饰的基因编辑的B细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的基因编辑的B细胞由(c1)和(d1)的步骤产生。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的基因编辑的B细胞由(c2)和(d2)的步骤产生。4.根据权利要求1所述的方法，其中(c1)和(d2)的步骤各自进一步被定义为两个或更多个递送步骤。5.根据权利要求4所述的方法，其中第一递送步骤包括递送靶向一种或多种基因的指导RNA，以及第二递送步骤包括递送靶向一种或多种基因的指导RNA，所述第二递送步骤中的所述基因不同于所述第一递送步骤中的一种或多种基因。6.根据权利要求5所述所述的方法，其中所述第一递送步骤和所述第二递送步骤之间的持续时间为至少约2天。7.根据权利要求5所述所述的方法，其中所述第一递送步骤和所述第二递送步骤之间的持续时间为约2
‑
3天。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述第一时间段在约44
‑
48小时之间。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述第二时间段是转导后约4
‑
5天。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中(b)的扩增在IL
‑
4、IL
‑
10、IL
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21、IL
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2、CpG、抗BCR或组合的存在下发生。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中(c1)或(d2)的步骤在IL
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4和/或IL
‑
21的存在下发生。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的方法，其中递送步骤通过电穿孔进行。13.根据权利要求12所述的方法，其中电穿孔使用约200,000个细胞至1x109个B细胞。14.根据权利要求12所述的方法，其中电穿孔使用约200,000至2,000,000个细胞。15.根据权利要求12所述的方法，其中电穿孔使用约1,000,000至1x109个B细胞。
16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中电穿孔步骤中指导RNA的浓度为3、4或5μM。17.根据权利要求1
‑
16中任一项所述的方法，其中电穿孔步骤中CpF1或Cas9核酸酶的浓度为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5μM。18.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL
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2、IL
‑
4、IL
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6、IL
‑
10或其组合。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞因子的浓度为100、125、150、175、200、225、250、275或300单位/ml或1
‑
500nM。20.根据权利要求1
‑
19中任一项所述的方法，其中所述异源抗原受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、趋化因子受体、归巢受体。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的方法，其中用一种或多种细胞因子基因和/或一种或多种免疫球蛋白转导或转染所述经刺激的B细胞、扩增的CD40L阳性B细胞、基因编辑的B细胞或经修饰的基因编辑的B细胞。22.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法，其中所述异源抗原受体靶向癌症抗原。23.根据权利要求1
‑
22中任一项所述的方法，其中所述异源抗原受体靶向选自以下的抗原：CD19、EBNA、CD123、HER2、CA
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125、TRAIL/DR4、CD20、CD70、癌胚抗原、甲胎蛋白、CD56、AKT、Her3、上皮肿瘤抗原、CD319(CS1)、ROR1、叶酸结合蛋白、HIV
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1包膜糖蛋白gp120、HIV
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1包膜糖蛋白gp41、CD5、CD23、CD30、HERV
‑
K、IL
‑
11Rα、κ链、λ链、CSPG4、CD33、CD47、CLL
‑
1、U5snRNP200、CD200、BAFF
‑
R、BCMA、CD99、p53、突变型p53、Ras、突变型ras、c
‑
Myc、胞浆丝氨酸/苏氨酸激酶、MAGE
‑
A1、MAGE
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A2、MAGE
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A3、MAGE
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A4、MAGE
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A6、MAGE
‑
A10、MAGE
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A12、MART
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1、黑素瘤相关抗原、BAGE、DAM
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6、
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10、GAGE
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1、GAGE
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2、GAGE
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3、GAGE
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4、GAGE
‑
5、GAGE
‑
6、GAGE
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7A、GAGE
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7B、GAGE
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8、NA88
‑
A、MC1R、MDA
‑
7、gp75、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白、TRP
‑
1、TRP
‑
2、ART
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4、CAMEL、CEA、Cyp
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B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：得克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：