检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。本发明专利技术提供了利用重组毕赤酵母高效地发酵生产β2

【技术实现步骤摘要】
检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法


[0001]本专利技术涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。

技术介绍

[0002]β2
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微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11.8KDa，由99个氨基酸组成的单链球蛋白。广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。Wibell发现血中β2
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微球蛋白与肌酐有明显的正相关，揭示了血、尿中β2
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微球蛋白是检测肾功能的灵敏指标。相较于其他传统的肾脏功能检测指标，β2
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微球蛋白在肾病初期就能被检测出来，更适合作为早期肾脏疾病的临床诊断标志物。人体内肾近曲小管对β2
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微球蛋白的重吸收率达到99％以上，正常情况下β2
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微球蛋白从体内的排出水平极低，一般临床检测尿样中β2
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微球蛋白的参考范围是0mg/L～0.3mg/L，在血液或血浆样本中最高含量为2.4mg/L。
[0003]该β2
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微球蛋白可与包被在胶乳颗粒上的羊抗人β2
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微球蛋白IgG结合产生浊度，在546nm处检测反应吸光度，吸光度值与β2
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微球蛋白的浓度成正相关。通过乳胶免疫比浊法对血液和尿液中β2
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微球蛋白进行测定最大优点是结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化。此外，这种方法操作简单、临床应用广泛。
[0004]β2
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微球蛋白的检测分为血液和尿液检测。检测血液中β2
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微球蛋白的含量可以提前发现肾小球的病变、高血压患者的肾功能前期受损情况，观察肾脏移植的排斥反应，它也是反映长期血透患者淀粉样变性的指标。检测尿液中β2
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微球蛋白含量来评定肾脏功能时，首先要检测血液中β2
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微球蛋白的含量，排除引起血液中β2
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微球蛋白含量增高的疾病。当血液中β2
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微球蛋白含量正常，但尿液中β2
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微球蛋白含量增高时，可进一步判断肾小管、肾小球功能是否正常、以及进行尿路感染定位等肾功能相关疾病的诊断。推进β2
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微球蛋白标准化，研制β2
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微球蛋白标准物质，对肾脏疾病早期诊断、病情预判以及后期治疗均有重要意义。
[0005]现存的制备方法的缺点表现在：诱导时间较长、补料速率的低、细胞表达量低、导致产量低并且表达出的蛋白准确度较低，不能够准确地表征抗原浓度变化，易形成包涵体、而且复性困难且易丧失免疫学活性，同时操作难度大，因此临床应用范围小。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。
[0007]本专利技术提供了编码β2
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微球蛋白的核酸，其具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
[0008]本专利技术还提供了包括所述的核酸的质粒载体。
[0009]本专利技术提供了表达β2
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微球蛋白的酵母，其表达如SEQ ID NO.1所示的核酸。
[0010]本专利技术提供的重组毕赤酵母，通过多次发酵试验，结果表明构建好的工程菌株抗原产量较高、稳定性较强。
[0011]本专利技术还提供了重组毕赤酵母菌株的构建方法：将质粒载体转化到酵母，所述方法具体包括扩增结束后，通过SDS
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PAGE电泳筛选出我们所需要的目的条带进行回收，对获得的核酸序列进行测序分析后，对获得的正确的基因序列进行重组构建，并后期通过对获得的诸多重组工程菌进行小样测试诱导蛋白的表达，对表达量较高的工程菌继续上罐验证，最终获得重组毕赤酵母。
[0012]本专利技术还提供了β2
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微球蛋白的制备方法，所述方法包括培养所述酵母，诱导蛋白表达。
[0013]本专利技术所述的方法，其中：所述起始生长阶段：温度为26℃～32℃，所述起始生长阶段包括：通过三区划线挑取单菌落于YNB培养基中，得到一级种子液；然后，取一级种子液接入BMGY培养基中，得到二级种子液。
[0014]所述起始生长阶段以MD固体培养基划线培养所述的酵母，以YNB培养基进行一级种子制备，以BMGY培养基进行二级种子制备。
[0015]一些具体实施例中，所述起始生长阶段：温度为28℃。
[0016]本专利技术所述的方法，其中：所述富集培养阶段，控制pH值为6.0
±
0.2，所述流加补料I维持发酵液溶氧为30％
±
5％；所述富集培养阶段以补料III控制pH值，然后流加补料I，所述补料I包括甘油和PTM1微量元素溶液，所述补料III为25vol％的氨水。本专利技术所述富集培养阶段中使用的含PTM1微量元素溶液的甘油，其中PTM1微量元素溶液的添加量为每1L的50％甘油中加入5ml。
[0017]一些实施例中，所述富集培养阶段：温度为30℃
±
1℃，初始搅拌转速为300rpm，通气量为1.0vvm，通过调节搅拌转速，维持发酵液溶氧为30％以上，搅拌转速不超过750rpm，发酵液的pH值为6.0。
[0018]另一些实施例中，所述富集培养阶段：温度为30℃
±
1℃，初始搅拌转速为300rpm，通气量为0.8vvm～1.5vvm，通过调节搅拌转速，维持发酵液溶氧维持在30％
±
5％，搅拌转速不超过750rpm，发酵液的pH值为6.0
±
2。
[0019]一些具体实施例中，所述富集培养阶段包括将本专利技术制得的种子液接种至用氨水调pH为6.0
±
0.2的BSM2发酵培养基中，溶氧下降又升高至50％，流加含PTM1的甘油，调节流加速率使发酵液溶氧维持在30％
±
5％，当酵母湿重达到诱导条件，停止流加含PTM1的甘油，最后，确保培养基中甘油全部耗尽，开始诱导重组毕赤酵母表达。
[0020]一些具体实施例中，所述富集培养阶段，搅拌转速达到750rpm～850rpm，溶氧下降又升高至50％以上，流加补料I以维持溶氧为30％
±
5％，直至酵母湿重达到150g/L～250g/L，停止流加补料Ⅰ，饥饿培养耗尽甘油，结束富集培养阶段。
[0021]另一些具体实施例中，所述富集培养阶段，搅拌转速达到750rpm，溶氧下降又升高至50％以上，流加补料I以维持溶氧为30％
±
5％，直至酵母湿重达到150g/L～200g/L，停止流加补料Ⅰ，饥饿培养耗尽甘油，结束富集培养阶段。
[0022]一些实施例中，所述诱导培养阶段：温度为28℃
±
1℃，pH为5.8～6.2，通气量为0.8vvm～1.5vvm。一些具体实施例中，所述诱导培养阶段：温度为26℃，pH为5.8～6.2，通气量为0.8vvm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码β2
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微球蛋白的核酸，其具有如SEQ ID NO.1所示的序列。2.包括权利要求1所述的核酸的质粒载体。3.表达β2
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微球蛋白的酵母，其特征在于，其表达如SEQ ID NO.1所示的核酸。4.β2
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微球蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求3所述的酵母，诱导蛋白表达。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括起始生长阶段、富集培养阶段和诱导培养阶段：所述起始生长阶段的培养基包括MD培养基、YNB培养基和BMGY培养基培养；所述富集培养阶段和所述诱导阶段的培养基包括BSM2培养基、PTM1、Biotin和YNB培养基。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述起始生长阶段依MD固体培养基划线培养权利要求3所述的酵母，以YNB培养基进行一级种子制备，以BMGY培养基进行二级种子制备；所述富集培养阶段以补料III控制pH值，然后流加补料I，所述补料I包括甘油和PTM1，所述补料III为25vol％的氨水；所述诱导培养阶段加入补料V后，流加补料II、补料Ⅳ和补料VI，所述补料II包括100％甲醇和PTM1；所述补料Ⅳ为15wt％的尿素溶液；所述补料V为200g/L蛋白胨溶液；所述补料VI为150g/L的硫酸镁溶液。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述富集培养阶段，控制pH至为6.0
±
0.2，所述流加补料I维持发...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗润发，刘梁涛，李建，邓娟，张文婧，赵巧辉，李桂林，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：