一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条及制备方法和应用技术

一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条及制备方法和应用。包括以下步骤：合成Au@Pd溶液、制备Au@Pd纳米酶免疫探针、侧流免疫层析试纸条的构建、试纸条检测C反应蛋白(CRP)以及进行催化放大反应。本方法中，利用Au@Pd纳米材料的颜色和过氧化物酶活性，在Au@Pd纳米颗粒颜色进行可视化检测的基础上，再催化放大，有效提高了检测灵敏度，此外，在进行催化放大时利用高粘度溶剂在T线处固定催化反应。明显改善了显色底物在试纸条上的扩散情况，使显色物集中固定检测T线上，实现了对CRP的快速、简便、灵敏的现场检测。敏的现场检测。敏的现场检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于免疫检测领域，涉及一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]C反应蛋白(CRP)是一种在宿主防御和炎症反应中起重要作用的急性期蛋白，人体一旦遭遇感染或组织损伤，体内CRP水平在数小时内急剧增加，因此CRP是一种重要的炎症标志物。当前临床分析中常规的CRP检测主要采用化学发光法、免疫比浊法和酶联免疫法(ELISA)。但这些方法都需要昂贵的仪器以及专业的操作和较长的分析时间，这极大地限制了它们在资源贫乏地区的普及，以及现场检测的要求。所以建立一种简便、快速、灵敏的CRP检测方法具有重要意义。
[0003]侧流免疫分析法(LFIA)因其具有成本低、快速、检测结果肉眼可见以及不需要专业的操作人员等优势，现在已发展成为临床诊断、食品安全检测和环境影响评估等领域的常规检测方法。金纳米粒子(AuNPs)是传统LFIA中应用最广的标签。然而，AuNPs由于其比表面积(球形)小、视觉对比度低等缺点，使其在高灵敏目标物检测中的使用受到限制。因此，亟需探索新的策略来提高LFIA的检测灵敏度。
[0004]为了克服这一发展的局限性，探索具有更多优越性质的标记物已成为研究热点。目前，常见的标记物有荧光、化学发光或SERS等具有高灵敏度性质的标记物，但这些标记物所产生的信号都需要专业的辅助设备来收集。此外。天然的过氧化物酶(HRP)也被用来作为标记催化增强显色结果，但是天然酶的活性极易受到温度、pH的影响从而使其催化活性大打折扣，这些缺点导致产品的不稳定同时也限制了天然酶在LFIA中的应用。
[0005]目前对于利用酶或具有类酶性质的材料在LFIA中进一步催化显色的应用中，配制有机底物时使用的溶剂大多为水，这也造成了一个不可避免的缺陷，即涂抹上去的有机底物和催化后产生的显色底物极易在试纸条上扩散，造成显色条带减弱，不利于观察到真实的显色情况和增强效果。
[0006]因此，开发简便、快速且低成本的分析方法对于CRP的检测具有意义重大。

技术实现思路

[0007]基于现有技术的以上缺点，本专利技术提供了一种操作简便、快速、灵敏的基于Au@Pd纳米酶和高粘度溶剂固定催化显色的免疫层析试纸条及制备方法和应用，实现了对CRP高显色灵敏度的可视化检测。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供了用于标记的Au@Pd纳米酶的制备方法，免疫探针的制备，试纸条的构建，高粘度催化显色液的配制以及相关的检测操作程序。
[0009]所述的Au@Pd纳米酶制备方法为：
[0010]1)Au@Pd纳米溶液的制备
[0011]①
AuNPs纳米溶液的制备
[0012]1mL质量分数为1％的氯金酸溶HAuCl4液加入到99mL超纯水中混合均匀，溶液加热沸腾后快速加入3mL1％的柠檬酸三钠溶液，沸腾至溶液颜色不再变化后继续加热十分钟后停止加热，在搅拌状态下冷却至室温，得到纳米金AuNPs溶液；
[0013]②
Au@Pd纳米溶液的制备
[0014]取合成好的纳米金AuNPs 20mL，加入1％的氯钯酸钠Na2PdCl4299μL和水2.4mL混匀后，向溶液中逐滴加入0.1M的抗坏血酸305μL，持续搅拌得到Au@Pd纳米溶液；
[0015]2)Au@Pd标记单克隆抗体制备Au@Pd
‑
mAb；
[0016]调节Au@Pd溶液的pH，采用静电吸附法，100μLAu@Pd溶液中加入4μL0.1M K2CO3调节pH，再加入终浓度为10～40μg/mL CRP的单克隆抗体mAb
‑
6G5与Au@Pd结合，反应1h后，加入终浓度为1％BSA封闭反应30min，最后加入终浓度为1％聚乙烯吡咯烷酮PVP 10K，封闭反应30min后，用9000rpm/min的转速，冷冻离心10min，弃上清液，将沉淀用重悬液重悬成50μL，4℃保存备用，即得到Au@Pd纳米酶免疫探针Au@Pd
‑
mAb
[0017]优选地，标记抗体浓度为35μg/mL；
[0018]优选地，重悬液的组成为质量分数1％牛血清蛋白(BSA)、1％聚乙烯吡咯烷酮PVP 10K、5％蔗糖和0.05％的吐温
‑
20(Tween
‑
20)，pH为8.8的Tris
‑
Hcl溶液。
[0019]3)基于Au@Pd纳米酶的侧流免疫层析检测试纸的构建
[0020]将处理后的样品垫、喷涂有检测线T线和质控线C线的硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸依次粘贴在聚氯乙烯PVC衬板上，将组装好的整条试纸条使用切条机剪切备用。得到基于Au@Pd纳米酶的侧流免疫层析检测试纸条。
[0021]其中，侧流免疫层析检测试纸的构建中样品垫和NC膜的处理方法包括：
[0022]样品垫：将样品垫置于样品垫封闭溶液中浸湿后，置于干燥的玻璃皿中，在37℃的烘箱中干燥过夜；得到处理后的样品垫。
[0023]NC膜：将目标检测物的另一个单克隆抗体mAb
‑
7G9稀释后均匀喷涂在NC膜上作为检测线T线，将羊抗鼠二抗均匀的喷涂在NC膜上作为质控线C线。T线和C线的距离为3～10mm，喷涂T线和C线后的NC膜在30～40℃的烘箱中干燥1～5h。
[0024]将处理过的样品垫、喷涂了T线和C线的NC膜、吸水纸依次粘贴在PVC衬板上，确保两个的连接部分有2mm左右宽度的重叠部分，得到侧流免疫层析检测试纸。
[0025]优选地，NC膜在37℃的烘箱中干燥3h；
[0026]优选地，检测线T线和质控线C线距离为5～10mm，最佳的5mm；
[0027]优选地，样品垫封闭溶液的配制成分为：质量分数10％牛血清蛋白，10％聚乙烯吡咯烷酮、3％蔗糖、以及体积比为0.05％的Tween
‑
20溶于pH值为7.0～9.0的PBS缓冲溶液；
[0028]本专利技术公开了采用上述制备方法制得的基于Au@Pd纳米酶的侧流免疫层析试纸条。
[0029]本专利技术还公开了一种基于Au@Pd纳米酶和高粘度溶剂固定催化显色的侧流免疫层析试纸条。
[0030]本专利技术公开了采用制备的基于Au@Pd纳米酶侧流免疫层析试纸条用于双抗体夹心法检测C反应蛋白的应用。
[0031]优选地，上述应用包括以下操作：
[0032]①
将制备的免疫探针Au@Pd
‑
mAb和含待测抗原CRP的样品溶液在微孔板中混匀孵
育5min；
[0033]②
将制备的免疫层析试纸条插入装有上述混合溶液的微孔板中，进行层析反应20min；
[0034]③
移取4μL、浓度为20mmol/L的显色有机底物、1μL浓度为9.8M的H2O2溶液和15μL的高粘度溶剂，均匀混合后得到显色溶液；
[0035]④...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括含有Au@Pd的纳米酶免疫探针及侧流免疫层析检测试纸，具体步骤如下：1)Au@Pd纳米溶液的制备
①
AuNPs的制备将氯金酸溶液加入到超纯水中混合均匀，溶液加热沸腾后快速加入柠檬酸三钠溶液，沸腾至溶液颜色不再变化后继续加热十分钟后停止加热，在搅拌状态下冷却至室温，得到AuNPs溶液；
②
Au@Pd纳米溶液的制备取合成好的AuNPs，加入氯钯酸钠混匀后，再向溶液中逐滴加入抗坏血酸，持续搅拌得到Au@Pd溶液；2)Au@Pd标记单克隆抗体制备Au@Pd
‑
mAb；调节Au@Pd溶液的pH，采用静电吸附法，将Au@Pd纳米溶液与CRP的单克隆抗体mAb
‑
6G5结合，经过封闭
‑
冷冻离心
‑
重悬得到Au@Pd纳米酶免疫探针Au@Pd
‑
mAb；3)基于Au@Pd纳米酶的侧流免疫层析检测试纸的构建将处理后的样品垫、喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在聚氯乙烯衬板上，组装好的整条试纸条使用切条机剪切备用，得到基于Au@Pd纳米酶的侧流免疫层析检测试纸条。2.根据权利1要求所述的一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤
①
和
②
中，所述氯金酸溶液、柠檬酸钠溶液、氯钯酸溶液的质量分数均为1％，抗坏血酸溶液浓度为0.1M，其中：所述氯金酸、柠檬酸钠、水的反应投料比为1～3mL﹕3～9mL﹕99～297mL；所述AuNPs溶液、氯钯酸钠、抗坏血酸和水的反应投料比为10～20mL﹕0.15～0.3mL﹕0.152～0.304mL﹕1.2～2.4mL。3.根据权利要求1所述的一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述处理后的样品垫的处理方法包括将样品垫置于样品垫封闭溶液中浸湿后，置于干燥的玻璃皿中，在30～40℃的烘箱中...

【专利技术属性】
技术研发人员：段忆翔，姚乃芝，黄志钧，李晓婷，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：