一种高活性FGF7蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高活性FGF7蛋白的制备方法。该制备方法包括以下步骤：1)构建pRSF

【技术实现步骤摘要】
一种高活性FGF7蛋白的制备方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种高活性FGF7蛋白的制备方法。

技术介绍

[0002]成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor,FGF7)又称角质生长因子KGF，是1989年由Rubin等人从人胚胎肺成纤维细胞中首先分离得到的一种细胞因子。特异性地与上皮细胞受体结合，引起细胞内一系列的信号传递，刺激上皮细胞的增殖、分化以及迁移，在上皮细胞的增殖与损伤修复中发挥独特的功能。小鼠和大鼠FGF7同源染色体研究表明，它涉及上皮形态功能的发生、伤口表皮细胞的再生、毛发的生长等。FGF7具有很多潜在应用，如在治疗糖尿病等代谢性疾病引起的慢性伤口愈合、早产儿支气管肺发育不良的应用、急性肺损伤、急性肝损伤的治疗等等均显示了较好的前景。FGF7存在多种突变体，蛋白结构和功能分析表明，肽链的前23个氨基酸的缺失并不降低FGF7的促有丝分裂活性。美国Amgen公司在大肠杆菌中表达N末端缺失23个氨基酸的KGF突变体palifermin(Kepivance
TM
)，用于放化疗引起的口腔粘膜炎的治疗，2004年12月被美国FDA批准上市。
[0003]FGF7具有广泛的药理活性，但是由于FGF7蛋白在生产上存在产量低、不稳定、易聚集、成本高等问题，严重限制了其药物研发进程。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种高活性FGF7蛋白的制备方法。本专利技术方法利用改造的载体表达FGF7蛋白，SUMO标签提高了目的蛋白的表达量和可溶性，同时非常方便纯化。利用SUMO酶切除，经过后续简单纯化即可获得纯度高、活性好的FGF7蛋白，为FGF7蛋白的生产提供了新的途径。
[0005]本专利技术采取的技术方案如下：
[0006]一种高活性FGF7蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)构建pRSF
‑
SUMO
‑
rmFGF7重组质粒；
[0008](2)将pRSF
‑
SUMO
‑
rmFGF7重组质粒转化至宿主菌，诱导表达，收集菌体；
[0009](3)将菌体超声破碎、离心、收集上清液；
[0010](4)将上清液经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到初步纯化物；
[0011](5)往初步纯化物中加入SUMO蛋白酶，进行透析酶切，将酶切物经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到无标签FGF7蛋白；
[0012](6)将无标签FGF7蛋白浓缩后，用分子筛Superdex 75柱洗脱，收集洗脱液，得到高活性FGF7蛋白。
[0013]优选的，步骤(1)中重组质粒的构建步骤为：将6
×
His
‑
SUMO序列插入pRSFDuet
‑
1载体的酶切位点Nco I、BamH I之间，得到pRSF
‑
SUMO载体，所述6
×
His
‑
SUMO序列如SEQ ID NO.1所示；将小鼠FGF7基因插入pRSF
‑
SUMO载体的酶切位点BamH I和Xho I之间，得到pRSF
‑
SUMO
‑
rmFGF7重组质粒。
[0014]优选的，步骤(2)中所述的诱导表达是使用IPTG进行诱导。
[0015]优选的，步骤(4)中所述的洗脱是用含有100mM～200mM咪唑的缓冲液洗脱，所述的缓冲液组成为25mM Tris，300mM NaCl，溶剂为水，pH8.0。
[0016]优选的，步骤(5)中所述的洗脱是使用含有0mM～20mM咪唑的缓冲液洗脱，所述的缓冲液组成为25mM Tris，300mM NaCl，溶剂为水，pH8.0。
[0017]优选的，步骤(5)中所述的透析酶切是加入预冷的100倍体积透析缓冲液在4℃中透析过夜；所述的透析缓冲液组成为25mM Tris，300mM NaCl，溶剂为水，pH8.0。
[0018]优选的，步骤(6)中所述的洗脱是使用PBS缓冲液洗脱，所述的PBS缓冲液组成为137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，溶剂为水，pH7.4。
[0019]本专利技术方法利用改造的载体，加入His
‑
SUMO标签，提高了目的蛋白的表达量和可溶性，同时非常方便纯化。从实验结果来看，通过第一次镍柱、SUMO酶酶切和第二次镍柱纯化即可达到95％以上的纯度，分子筛纯化表明所获得的rmFGF7蛋白均一性良好，无二聚体现象，并且1L菌液可获得8.4mg的蛋白(1.4mg/mL蛋白溶液共6mL)。综合来说，本专利技术方法通过2次镍柱纯化即可获得具有高生物活性、高纯度的rmFGF7蛋白。
附图说明
[0020]图1为小鼠FGF7基因扩增结果。条带1为PCR产物，条带2为Marker。
[0021]图2为重组质粒pRSF
‑
SUMO
‑
rmFGF7的构建示意图。a为rmFGF7表达质粒pRSF
‑
SUMO
‑
rmFGF7的构建，成熟的FGF7序列插入到改造pRSF
‑
SUMO载体BamH I和Xho I限制性内切酶之间，b为rmFGF7以融合蛋白的形式被表达，N端带有His、SUMO标签和SUMO酶切位点。
[0022]图3为含His
‑
SUMO标签的rmFGF7第一次镍柱纯化。
[0023]图4为SUMO酶酶切及第二次镍柱纯化。
[0024]图5为分子筛纯化。
[0025]图6为银染及Western blotting检测。
[0026]图7为纯化rmFGF7活性测定。
具体实施方式
[0027]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0028]实施例1
[0029]1、材料
[0030]大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司。pRSFDuet
‑
1质粒为实验室保存。小鼠FGF7抗体购自santa cruz公司。限制性核酸内切酶Nco I、BamH I、Xho I、pfu DNA聚合酶、T4 DNA ligase、蛋白分子量Marker购自Thermo Scientific。DNA快速纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒、硫酸卡那霉素购自上海生工生物工程技术有限公司。Trizol和逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)购自广州赛国生物科技有限公司。其他生化试剂均为国产分析纯。本工作中所用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成(表1)。
[0031]表1引物序列
[0032]引物名本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高活性FGF7蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建pRSF
‑
SUMO
‑
rmFGF7重组质粒；(2)将pRSF
‑
SUMO
‑
rmFGF7重组质粒转化至宿主菌，诱导表达，收集菌体；(3)将菌体超声破碎、离心、收集上清液；(4)将上清液经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到初步纯化物；(5)往初步纯化物中加入SUMO蛋白酶，进行透析酶切，将酶切物经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到无标签FGF7蛋白；(6)将无标签FGF7蛋白浓缩后，用分子筛Superdex 75柱洗脱，收集洗脱液，得到高活性FGF7蛋白。2.根据权利要求1所述的高活性FGF7蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中重组质粒的构建步骤为：将6
×
His
‑
SUMO序列插入pRSFDuet
‑
1载体的酶切位点Nco I、BamH I之间，得到pRSF
‑
SUMO载体，所述6
×
His
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SUMO序列如SEQ ID NO.1所示；将小鼠FGF7基因插入pRSF
‑
SUMO载体的酶切位点BamH I...

【专利技术属性】
技术研发人员：关文，姚宏亮，王华敏，张亚莉，李刚，
申请(专利权)人：广东省科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：