一种胶乳增强免疫抑制法定量测定全血中雷帕霉素的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种胶乳增强免疫抑制法定量测定全血中雷帕霉素的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1，所述试剂R1包含胶乳微球

【技术实现步骤摘要】
一种胶乳增强免疫抑制法定量测定全血中雷帕霉素的试剂盒


[0001]本专利技术属于生化检测领域，具体涉及一种胶乳增强免疫抑制法定量测定全血中雷帕霉素试剂盒。

技术介绍

[0002]雷帕霉素(RAPA)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂。雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。从临床应用来看，雷帕霉素有很好的抗排斥作用，且与环孢霉素A(CsA)和FK506等免疫抑制剂有良好的协同作用，是一种疗效好，低毒，无肾毒性的新型免疫抑制剂。
[0003]雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，雷帕霉素可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路。雷帕霉素和FK506一样，结合在相同的免疫亲和蛋白(immunophilin)FKBP12上，形成RAPA
‑
FKBP12复合物，这种复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素亦不抑制T细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成。这种复合物的靶蛋白最早是在酵母菌中，被称为TOR1和TOR2。
[0004]雷帕霉素在动物实验和临床应用中的给药方式较多，有腹腔内注射、静脉注射及口服等。口服用药后约1.5
‑
2小时可达峰值，口服后的平均生物利用度在肾移植受者为15％，半衰期为62小时。药物吸收入血后，95％分布于红细胞内，血浆中含量只占3％，游离状态存在的药物极少。因此临床上以全血标本来监测雷帕霉素的血药浓度。血药的Cmax和AUC值与剂量成正比。检测血药浓度在国际上较多采用的是高效液相色谱法(HPLC)，该方法较为复杂。
[0005]NTA
‑
Ni
‑
His标签
[0006]在1987年，Hochuli等人专利技术了改进的金属螯合配体次氮基三乙酸(NTA)，伴随着现代分子生物学和重组蛋白技术的高速发展，基于NTA配体在纯化组氨酸标签(his
‑
tagged)蛋白方面得到了很重要的应用。
[0007]众所周知，广泛使用的金属离子为Ni
2+
，其周围共有六个配位点供配体结合。IDA是三齿配体，即可以结合Ni
2+
周围的三个配位点，剩余的三个配位点中两个用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基，另一个用于和H2O配位结合，因此，IDA对Ni
2+
的结合能力相对较弱，造成结合到介质上的Ni
2+
容易脱落，致使介质的性能不稳定。而NTA是四齿配体，即NTA可以结合Ni
2+
周围的四个配位点，剩余两个配位点用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基。
[0008]Fc受体蛋白
[0009]Fc受体指一系类细胞膜表面能与IgFc片段结合的受体。在免疫学中，具有Fc受体细胞一般有B细胞、杀伤细胞、巨噬细胞。抗体是由免疫细胞产生的特殊蛋白质，可以与抗原如微生物、毒素或过敏物质结合。当免疫细胞上的Fc受体与抗体及其附着的抗原结合时，可以引发吞噬作用，这样会消耗被抗体包被的抗原。
[0010]基于不同类型的抗体，会存在不同的特异性抗原。这也意味着也存在不同的Fc受
体，每个Fc受体能够在其Fc区结合抗体。抗体也称为免疫球蛋白，简称Ig，并且最常见于血液中的IgG类型。Fc受体主要分为三类，包括Fc
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γ受体，Fc
‑
α受体和Fc
‑
ε受体。每种类型的Fc受体包含基于遗传同源性的几种亚型，比如Fc
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γ受体可结合IgG的Fc片段，Fc
‑
α受体可结合IgA的Fc片段，Fc
‑
ε受体可结合IgE的Fc片段。
[0011]胶乳增强免疫竞争法是目前用于检测样本中药物小分子浓度的常用方法，该方法的原理是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，药物小分子(样本中的半抗原)和药物
‑
蛋白复合物(人工构建的抗原)两者同时竞争结合胶乳微球表面的抗体位点，反应体系的浊度大小与样本中的药物小分子浓度呈负相关，通过测定反应液的吸光度，计算样本中药物小分子的浓度，但目前该方法检测的灵敏度还不够高。

技术实现思路

[0012]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中检测药物小分子雷帕霉素的方法较为复杂、灵敏度低、抗体位阻大等缺陷，从而提供了一种利用胶乳增强免疫抑制法低位阻高灵敏度定量测定全血中免疫抑制剂雷帕霉素的试剂盒。其具体原理如下：
[0013]在测定雷帕霉素浓度之前，对全血样本进行预处理，将全血中细胞内与蛋白结合的雷帕霉素提取出来。检测过程中，从样本中提取的雷帕霉素药物预先结合胶乳微球表面的抗雷帕霉素抗体，未被结合位点的抗体再与雷帕霉素
‑
蛋白复合物中的雷帕霉素结合，产生凝集反应；整个过程是样本中的待测物抑制致敏微球与蛋白复合物的凝集反应。样本中的雷帕霉素浓度越高，胶乳表面抗体被其结合的程度越大，与雷帕霉素
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蛋白复合物产生的胶乳聚集反应被抑制的越多，反应越低，反应体系的浊度大小与样本中的雷帕霉素浓度呈负相关，通过测定546nm附近的吸光度，计算全血样本雷帕霉素的浓度。
[0014]本专利技术的另一项创新点为，本专利技术使用的结合抗雷帕霉素单克隆抗体的纳米胶乳微球，能够定向结合抗体Fc片段，有效减小抗体位阻，使得抗体活性位点充分暴露，提高灵敏度，其示意图如图1所示。
[0015]本专利技术所用的抗雷帕霉素单克隆抗体可以通过利用实施例3中所述的方法进行制备，并从中筛选出效果最好的抗体应用在本专利技术中。但本专利技术可用的抗雷帕霉素单克隆抗体不限于此，任何通过商业途径购买得到的抗雷帕霉素单克隆抗体只要其类型能对应上特异性的Fc受体蛋白，就都能够达到与本专利技术相当的技术效果。
[0016]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一为：一种定量测定雷帕霉素的试剂盒，包括试剂R1，所述试剂R1包含胶乳微球
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NTA
‑
Ni
‑
Fc受体
‑
抗雷帕霉素单克隆抗体。
[0017]如技术方案之一所述的试剂盒，所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体
‑
抗雷帕霉素单克隆抗体的制备方法包含以下步骤，反应的示意图如图2和图3所示：
[0018]i)胶乳微球共价结合N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸(末端有NTA结构)，制成胶乳微球
‑
NTA。
[0019]ii)所述胶乳微球
‑
NTA结合Ni离子，制成胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni。
[0020]iii)所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni结合带His标签的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量测定雷帕霉素的试剂盒，包括试剂R1，其特征在于，所述试剂R1包含胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体
‑
抗雷帕霉素单克隆抗体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体
‑
抗雷帕霉素单克隆抗体的制备方法包含以下步骤：i)胶乳微球共价结合N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸，制成胶乳微球
‑
NTA；ii)所述胶乳微球
‑
NTA结合Ni离子，制成胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni；iii)所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni结合带His标签的Fc受体，制成胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体；iv)所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体结合抗雷帕霉素单克隆抗体的Fc端，制成所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体
‑
抗雷帕霉素单克隆抗体。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，当所述胶乳微球为羧基胶乳微球时，i)中所述胶乳微球
‑
NTA的制备具体包含以下步骤：(1)将粒径50nm～350nm的所述羧基胶乳微球分散在pH 5.8～6.5的MES中，使得微球质量体积百分比为1％，加入N
‑
羟基丁二酰亚胺和1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，于室温反应0.5
‑
3h；(2)离心弃去上清，用pH 5.8～6.5的MES重悬；(3)加入0.5～3mg/mL的N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸，反应1
‑
3h；(4)加入30～50mmol伯胺，封闭反应1
‑
3h；(5)离心弃去上清，用pH 6.8～8.5的PBS重悬，制成所述胶乳微球
‑
NTA。4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，当所述胶乳微球为氨基微球时，i)中所述胶乳微球
‑
NTA的制备具体包含以下步骤：(1)将粒径50nm～350nm的所述氨基胶乳微球分散在pH 7.5～8.5的PBS中，使得微球质量体积百分比为1％，加入体积分数为5％～30％的戊二醛，于室温反应0.5
‑
3h；(2)离心弃去上清，用pH 7.5～8.5的PBS重悬；(3)加入0.5～3mg/mL的N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸，反应1
‑
3h；(4)加入30～50mmol NaBH4，封闭反应1
‑
3h；(5)离心弃去上清，用pH 6.8～8.5的PBS重悬，制成所述胶乳微球
‑
NTA。5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，ii)中所述胶乳微球
‑
NTA

【专利技术属性】
技术研发人员：林巍靖，宋晓婵，覃林娟，
申请(专利权)人：上海健耕医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：