一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法，在murG起始codon前插入4

【技术实现步骤摘要】
一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体的说是涉及一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法。

技术介绍

[0002]乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)是革兰氏阳性菌，无运动性，兼性厌氧菌，隶属于厚壁菌门芽孢杆菌纲乳杆菌目乳杆菌科片球菌属，呈圆球状，分裂后一般细胞成对或者成团排列，不成链状。乳酸片球菌具有改善动物机体肠道形态、调控血清生化指标、治疗便秘、腹泻、增强免疫功能、维持肠道微生态平衡和调节胃肠道菌群的功能，位列在农业农村部允许使用的菌种目录中。乳酸片球菌因具有无污染、无残留等优势，可代替或减少抗生素的应用，保证了食品安全。乳酸片球菌还可以做为产乳酸的发酵菌株，进行科学研究和工业生产。
[0003]为了探索乳酸片球菌的代谢调控分子机制，需要进行相应的基因操作。通常，会在乳酸片球菌中通过质粒进行基因的过表达或基因敲除等手段来了解相关基因的作用。目前为止，在乳酸片球菌都是通过电转化的方式把质粒转入菌中。研究者们通过优化电转电压、感受态浓度、质粒浓度、菌生长OD、培养基中添加苏氨酸、溶菌酶破壁浓度等各种参数提高电转化效率。感受态细胞对电转化效率影响权重较大。因为乳酸片球菌是革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，现在常用的感受态制备方法是在培养细胞的培养基中加入苏氨酸使细胞壁不完整，出现“残缺”，其后利用溶菌酶进一步破坏细胞壁，使细胞成感受态，易于“吸入”质粒而电转成功。遗憾的是，乳酸片球菌质粒的转化效率一直不高，虽然对挑取转化成功阳性菌落影响不大。但是，有些基因操作是需要高转化效率才能进行下去。比如，优化改造木糖苷酶(xylosidase)在乳酸片球菌中的酶解效率，酶基因进行易错pcr，混合酶基因和质粒进行连接后电转化入乳酸片球菌感受态细胞，筛选平板中加入对硝基酚木糖苷，培养3天后进行高通量筛选，如果木糖苷酶效率变高，会产生黄色的对硝基酚，菌落周边会出现黄色斑迹，根据其大小挑选菌落再进行酶效率的验证。此时，如果转化效率低下，筛选平板上的阳性菌落数少，达不到高通量筛选的效果，对酶基因进行优化改造将非常困难。
[0004]在原核生物的基因表达中，核糖体结合位点(ribosome binding site，简称RBS)和基因起始codon(AUG)之间的距离影响翻译(translation)效率，其间长度一般为5
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8个碱基，如果加长，效率会随之下降。
[0005]革兰氏阳性菌细胞壁较厚，化学组成简单，一般有90％肽聚糖和10％磷壁酸组成。细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在。细菌合成肽聚糖的途径已经解析出来了，其中MraY负责催化UDP
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N
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acetylmuramic acid
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pentapeptide(磷酸
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N
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乙酰胞壁酸酯
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胸腺喷丁)和脂质载体十一异戊烯磷酸合成细胞壁前体脂I(Lipid I)，再由MurG催化与N
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乙酰葡萄糖胺结合形成Lipid II(肽聚糖的重要前体)。同时，在乳酸片球菌中marY和murG基因序列高度保守，本专利技术利用此原理，把乳酸片球菌的murG基因与RBS之间的距离加长使其表达弱化，造成其细胞壁的不完善，最终制备的感受态细胞大幅提高了转化效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是：设计一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法，通过把RBS和murG基因起始codon(AUG)之间的碱基加长来弱化细胞壁合成的murG基因的表达，造成其细胞壁的不完善，最终制备的感受态细胞大幅提高了转化效率。此方法只需把菌改造一次，之后因为电转化效率的大幅提高，基因操作简单，阳性率高，特别是可用于高通量筛选用。
[0007]本专利技术的另一目的是提供一种经过碱基加长的高电转化效率的乳酸片球菌基因工程菌，所述基因工程菌RBS和murG基因起始codon(AUG)之间的碱基加长，电转化效率的大幅提高。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0009]一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法，在murG起始codon前插入4
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8个碱基序列，把RBS和murG基因起始codon之间的碱基加长来弱化细胞壁合成的murG基因的表达，造成其细胞壁的不完善，提高乳酸片球菌的电转化效率。
[0010]在murG起始codon前插入的碱基序列为除了AG组合以外的A、T、C、G任意组合。
[0011]在murG起始codon前插入的碱基序列优选为(AC)n，n＝2～4。
[0012]插入的碱基序列主要限定长度，长度小于4几乎无效果，大于8效果差，优选插入4～8个碱基，进一步优选插入6个碱基。
[0013]插入的碱基序列没有特别的限定，A、T、C、G任意组合，要避免出现A和G的组合，因为A和G组合极易出现和RBS类似序列，会被核糖体误识别成RBS，从而不影响翻译效率，比如aaggag、agagag这种ag组合一起的，电转化效率提高不显著。插入的碱基序列优选为AC AC AC。
[0014]包括如下步骤：
[0015]1)制备敲入质粒pSET4e
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rbslength，以敲除质粒pSET4e为模板，设计引物序列1得到质粒骨架序列pSET4eb，以乳酸片球菌基因组为模板，分别设计引物序列2和引物序列3进行无缝克隆，pcr得到同源臂右片段序列murGR和同源臂左片段序列RBSmurGF；
[0016]2)把序列片段murGR、RBSmurGF和质粒骨架pSET4eb进行连接后转入大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞，涂布LB平板后培养挑选阳性菌落验证筛选，获得在RBS位点后含有增加碱基的敲入质粒pSET4e
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rbslength的大肠杆菌；然后进行质粒抽提获得质粒pSET4e
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rbslength；
[0017]3)制备乳酸片球菌常规感受态细胞；
[0018]4)将敲入质粒pSET4e
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rbslength转入乳酸片球菌；
[0019]5)将含有质粒pSET4e
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rbslength的乳酸片球菌进行单交换，使敲入质粒进入乳酸片球菌基因组；
[0020]6)将单交换的乳酸片球菌进行双交换，使质粒序列部分从基因组中脱离，RBS和murG基因起始codon(AUG)之间的碱基得到了加长碱基序列；弱化细胞壁合成的murG基因的表达，提高乳酸片球菌的电转化效率。
[0021]引物序列1为pSET_primerF:GCAACTGTTGGGAAGGGCGATC
[0022]pSET_primerR:GCAGCCTGAATGGCGAATGGCG。
[0023]引物序列2为：murG_primerF：atgagactgatggtttcaggag，
[0024]murG_primerR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法，其特性在于：在murG起始codon前插入4
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8个碱基序列，把RBS和murG基因起始codon之间的碱基加长来弱化细胞壁合成的murG基因的表达，造成其细胞壁的不完善，提高乳酸片球菌的电转化效率。2.根据权利要求1所述的一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法，其特性在于：在murG起始codon前插入的碱基序列为(AC)n，n＝2～4。3.根据权利要求1所述的一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法，其特性在于：包括如下步骤：1)制备敲入质粒pSET4e
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rbslength，以敲除质粒pSET4e为模板，设计引物序列1得到质粒骨架序列pSET4eb，以乳酸片球菌基因组为模板，分别设计引物序列2和引物序列3进行无缝克隆，PCR得到同源臂右片段序列murGR和同源臂左片段序列RBSmurGF；2)把序列片段murGR、RBSmurGF和质粒骨架pSET4eb进行连接后转入大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞，涂布LB平板后培养挑选阳性菌落验证筛选，获得在RBS位点后含有增加碱基的敲入质粒pSET4e
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rbslength的大肠杆菌；然后进行质粒抽提获得质粒pSET4e
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rbslength；3)制备乳酸片球菌常规感受态细胞；4)将敲入质粒pSET4e
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rbslength转入乳酸片球菌；5)将含有质粒pSET4e
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rbslength的乳酸片球菌进行单交换，使敲入质粒进入乳酸片球菌基因组；6)将单交换的乳酸片球菌进行双交换，使质粒序列部分从基因组中脱离，RBS和murG基因起始codon(AUG)之间的碱基得到了加长碱基序列；弱化细胞壁合成的murG基因的表达，提高乳酸片球菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺建龙，邱忠洋，夏军，吴真，李相前，仇叶娟，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：