一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法，包括以下步骤：通过蛋白沉淀处理和固相萃取净化对标准基质工作溶液和待测生物体液进行处理，随后进行液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法


[0001]本专利技术涉及一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法，涉及分析化学


技术介绍

[0002]草甘膦和草铵膦是一类非选择性、内吸型除草剂，在我国农药生产中应用广泛，据统计，这两种农药的生产量和使用量均位于世界前列。草甘膦和草铵膦的毒性不大，但也有研究表明其具有一定的致癌风险，加之投毒、误服、自杀等原因的中毒(案)事件时有发生，导致生物体液内草甘膦、草铵膦及代谢物的检测需求逐渐增大。
[0003]由于液相色谱
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质谱联用技术具备灵敏度高，分析范围广，分析时间短等优点而被广泛应用于化合物的检测中，但是基于生物体液的复杂性和草甘膦、草铵膦及代谢物(以下简称待测化合物)的化学性质，常规检测方法的效果并不理想，例如，生物体液中的基质会对待测化合物存在干扰，导致待测化合物的保留时间无法与标准品对应，重现性较差；草甘膦、草铵膦及代谢物均为强极性化合物，易溶水，无法通过常规色谱条件进行分离，目前可以通过衍生化的方法，降低草甘膦和草铵膦及代谢物的极性，延长保留时间，但是衍生化方法比较复杂，容易造成待测样品的浪费，检测灵敏度降低，因此，如何合理利用液相色谱
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质谱联用技术检测生物体液中是否含有草甘膦、草铵膦及代谢物受到了越来越多的关注。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种利用液相色谱
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质谱联用技术检测生物体液中是否含有草甘膦、草铵膦及代谢物的方法，该方法可避免生物体液中基质的影响，重现性好，并且该方法无需衍生化过程，灵敏度高，用量少，可满足司法鉴定的需求。
[0005]本专利技术提供了一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法，包括以下步骤：
[0006]在空白生物体液内加入草甘膦、草铵膦及代谢物的标准品，配制成标准基质工作溶液，对所述标准基质工作溶液依次进行蛋白沉淀处理和固相萃取处理后进行液相色谱
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质谱分析，得到标准基质工作溶液的分析结果；
[0007]采用与标准基质工作溶液相同的方法对待测生物体液进行处理和液相色谱
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质谱分析，得到待测生物体液的分析结果；
[0008]将待测生物体液与标准基质工作溶液的分析结果进行比对，确认生物体液中是否含有草甘膦、草铵膦及代谢物；
[0009]其中，液相色谱条件包括：色谱柱为阴离子色谱柱，流动相A为纯水，流动相B为碳酸氢铵溶液和氨水，梯度洗脱。
[0010]本专利技术提供了一种利用液相色谱
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质谱联用技术检测生物体液中草甘膦和草铵膦及代谢物的方法，可对生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物进行定性分析，本领域技术人员知晓，当草甘膦或草铵膦进入人体后会发生代谢，草甘膦代谢产生氨甲基膦酸、N
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乙酰草甘
膦、N
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甲基草甘膦，草铵膦代谢产生N
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乙酰氨甲基磷酸、3
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甲基磷酸亚基丙酸、N
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乙酰草铵膦，因此，本专利技术提供的方法可同时检测生物体液中草甘膦、氨甲基膦酸、N
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乙酰草甘膦、N
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甲基草甘膦、草铵膦、N
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乙酰氨甲基磷酸、3
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甲基磷酸亚基丙酸、N
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乙酰草铵膦共8种化合物，检测过程中，首先对标准基质工作溶液和待测生物体液依次进行蛋白沉淀处理和固相萃取处理，去除生物体液中的蛋白基质和脂类杂质，接着将处理后的标准基质工作溶液和待测生物体液进行液相色谱
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质谱分析，经专利技术人实验发现，常规的液相色谱柱对强极性物质的分离效果并不理想，因此本专利技术使用阴离子色谱柱，纯水作为流动相A，碳酸氢铵溶液和氨水作为流动相B进行液相色谱
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质谱分析，最后将标准基质工作溶液和待测生物体液的分析结果进行比对即可确定待测生物体液内是否含有草甘膦、草铵膦及代谢物，完成检测过程。本专利技术提供的检测方法，可有效对生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物共8种化合物进行同时检测，检测过程中8种化合物的保留时间稳定，检测重现性较高，同时也省去了检测前衍生化或柱后衍生化的步骤，提高了检测灵敏度，节约了生物体液的使用量，适用于在检材量有限，尤其是涉及到死亡的案例检测。
[0011]上述方法涉及生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的定性分析，同时，本专利技术提供的方法还可以用于生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的定量分析，具体包括如下步骤：
[0012]在空白生物体液内加入草甘膦、草铵膦及代谢物的标准品，配制成一系列浓度的标准基质工作溶液，对所述一系列浓度的标准基质工作溶液依次进行蛋白沉淀处理、固相萃取处理和液相色谱
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质谱分析，制作标准工作曲线；
[0013]将所述待测生物体液的分析结果与标准工作曲线比对，计算出待测生物体液内草甘膦、草铵膦及代谢物的含量。
[0014]在定性检测的基础上，本领域技术人员可通过常规技术手段建立标准工作曲线，对生物体液内草甘膦、草铵膦及代谢物进行定量分析，二者所使用的蛋白沉淀处理、固相萃取处理和液相色谱
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质谱分析方法相同，以下进行详细阐述：
[0015]首先，采集空白生物体液，加入草甘膦、草铵膦及代谢物共8种化合物标准品，配制得到标准基质工作溶液；采集待测生物体液，生物体液是指来源于生物体内的液体，具体地，所述生物体液包括血液或尿液，标准基质工作溶液中8种待测化合物的浓度可根据常规技术手段进行设置。
[0016]其次，将标准基质工作溶液和待测生物体液统称为待处理溶液，对待处理溶液依次进行蛋白沉淀处理和固相萃取处理，所述蛋白沉淀处理包括在待处理溶液内加入乙腈后冷冻离心取上清液；所述固相萃取处理使用CleanertPEP Plus固相萃取柱。
[0017]以标准基质工作溶液为例：在标准基质工作溶液内加入蛋白沉淀剂乙腈，振荡混匀后冷冻离心并取上清液，将上清液经Cleanert PEP Plus固相萃取柱进行固相萃取过滤，上清液中的脂类物质保留在固相萃取柱上，收集滤液备用。
[0018]将收集的滤液进行液相色谱
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质谱分析，由于液相色谱
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质谱分析仪器对分析样品的要求较高，在分析前需使用0.22μm有机微孔滤膜对待分析溶液进行过滤以去除杂质。
[0019]液相色谱
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质谱分析中，液相色谱条件包括：
[0020]所述阴离子色谱柱为150mm
×
4.0mm，5μm的Metrosep A Supp 5阴离子色谱柱，柱温40℃；
[0021]进一步地，进样量为5μL，流速为0.6mL/min，所述流动相B包括200 mM/L的碳酸氢
胺和0.1v/v％的氨水。
[0022]进一步地，为了更好的同时对8种待测化合物进行分析，本专利技术所使用的梯度洗脱条件见表1：
[0023]表1液相色谱
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：在空白生物体液内加入草甘膦、草铵膦及代谢物的标准品，配制成标准基质工作溶液，对所述标准基质工作溶液依次进行蛋白沉淀处理和固相萃取处理后进行液相色谱
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质谱分析，得到标准基质工作溶液的分析结果；采用与标准基质工作溶液相同的方法对待测生物体液进行处理和液相色谱
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质谱分析，得到待测生物体液的分析结果；将待测生物体液与标准基质工作溶液的分析结果进行比对，确认生物体液中是否含有草甘膦、草铵膦及代谢物；其中，液相色谱条件包括：色谱柱为阴离子色谱柱，流动相A为纯水，流动相B为碳酸氢铵溶液和氨水，梯度洗脱。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还可以包括以下步骤：在空白生物体液内加入草甘膦、草铵膦及代谢物的标准品，配制成一系列浓度的标准基质工作溶液，对所述一系列浓度的标准基质工作溶液依次进行蛋白沉淀处理、固相萃取处理和液相色谱
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质谱分析，制作标准工作曲线；将所述待测生物体液的分析结果与标准工作曲线比对，计算出待测生物体液内草甘膦、草铵膦及代谢物的含量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测生物体液包括血液或尿液。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白沉淀处理包括在待处理溶液内加入乙腈后冷冻离心取上清液。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云峰，常靖，董林沛，王爱华，任昕昕，王瑞花，吴小军，宋歌，邹波，赵鹏，李佳宜，魏春明，侯小平，于忠山，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：