一种将鞭毛运动蛋白motA应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种将鞭毛运动蛋白motA应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法。所述大肠杆菌基因工程菌是向大肠杆菌W1688中导入含esaI/R系统的pUC19

【技术实现步骤摘要】
一种将鞭毛运动蛋白motA应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种将鞭毛运动蛋白motA应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法。

技术介绍

[0002]生物膜(biofilm)是自然界中微生物群落的一种形态。微生物聚集在一起，并分泌有机物，如多糖类物质覆盖其表面，形成一层膜状物质。微生物通过形成这种群落结构能够更好的适应外界环境，抵抗不利于生存的因素。在医学领域，由于致病菌常形成生物膜使得菌体耐药性提高，对于生物膜的研究已持续了较长的时间。而在工业发酵应用领域，生物膜形成的机理研究相对较少。特别是针对固定化细胞发酵特征的分子研究。
[0003]在许多致病菌的存活和毒力至关重要，鞭毛扮演着重要角色。细菌使用旋转的鞭毛来推动自己，移动能力对细菌的生存和致病性至关重要，鞭毛由起推进器作用的长外丝、柔性连接结构、钩和嵌入细胞包膜中的马达组成。与产生机械运动的其他生物大分子系统(例如肌肉中的肌球蛋白)不同，细菌鞭毛运动不直接使用ATP水解的能量。鞭毛旋转由跨细胞质的电化学梯度的能量提供动力。细菌鞭毛运动用作膜嵌入式离子动力旋转发动机，离子动力旋转发动机由一个被一环定子蛋白质复合体(MotAB)包围的转子组成，为其旋转提供动力。马达是双向的：化学趋化信号可以导致转子的构象变化，称为“切换”，这会导致马达旋转方向的改变。每个motA motB复合物被认为含有两个质子传导通道，跨越细胞质膜。
[0004]在生物膜发育的早期阶段，由于附着在表面上的黏附基因使大肠杆菌细胞无柄，因此抑制了鞭毛的合成。环二鸟苷酸(c
‑
di
‑
GMP)等几种小分子负责从浮游状态向固着状态的转变。在运动状态下c
‑
di
‑
GMP的浓度较低，随着生物膜的逐渐成熟，其浓度也会升高。motA motB复合物在大肠杆菌运动及菌体与表面的不可逆附着中有重要作用。
[0005]群体感应(quorum sensing，QS)是一种细菌细胞与细胞间的通讯系统，微生物间通过分泌扩散性小分子信号感知细菌群体的密度的变化，从而引起一组特定基因在转录水平协调表达。这种交流可使细菌表达不同的生理行为，包括调控生物发光、生物膜的形成、产生毒素、孢子的形成等。
[0006]随着对群体感应作用机制的研究深入，这一生物学特性可用于开发一种细胞密度依赖的自诱导动态调控工具。在大肠杆菌中，缺乏与LuxI具有相似功能负责合成AHLs的基因，它本身不能产生AHL信号分子，但是它们能编码LuxR同源蛋白，因此可以感应并对其他细菌产生的AHLs进行应答。
[0007]目前研究最多、应用最广的AHL介导的群体感应系统主要是来自于费氏弧菌的luxI/luxR系统和来自于玉米细菌性枯萎病菌中的esaI/esaR系统。在革兰阴性细菌的中，由luxI/luxR双组分构成的QS系统研究最广泛。而esaI/esaR系统与luxI/luxR系统同源，起源于玉米病原菌Pantoea stewartii亚种。与大多数LuxR同源物不同，esaR可以同时作为转录激活因子和抑制因子，并不依赖于是否和AHL信号分子结合。另外，PesaR是一种受esaR抑
ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的P
esaS
‑
F、P
esaS
‑
R、P
esaR
‑
P
‑
F、P
esaR
‑
P
‑
R。
[0023]步骤(1)中，扩增mCherry、EGFP基因的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的mcherry
‑
F、mcherry
‑
R、EGFP
‑
F、EGFP
‑
R。
[0024]为了解决上述第三个技术问题，本专利技术公开了述大大肠杆菌基因工程菌在产L
‑
苏氨酸中的应用。
[0025]其中，所述应用为将核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的苏氨酸合成酶thrC替换到所述大大肠杆菌基因工程菌中EGFP基因的位置，再将该菌接种LB培养基中培养得到菌液，所得菌液稀释至OD＝0.05～0.15后，接种到含有固定化载体的发酵培养基中进行固定化发酵产木聚糖酶。
[0026]其中，所述发酵培养基为葡萄糖30g/L，氯化钠0.8g/L，硫酸铵20
‑
22g/L，无水磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.8g/L，五水合硫酸锰0.02g/L，七水合硫酸铁0.02g/L，维生素B1 0.002g/L，酵母粉1g/L，碳酸钙15
‑
30g/L。
[0027]其中，所述固定化载体为棉纤维。
[0028]其中，所述固定化载体的用量为3～7g/100mL发酵培养基。
[0029]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：
[0030]本专利技术首次将大肠杆菌成膜相关的运动基因motA与群体感应系统esaI/R结合，通过群体感应信号分子之间的信号传递控制生物膜的形成、分解与扩散，建立特异性的调控方式，精确调控发酵过程中生物膜的形成过程，加强生物膜在发酵前中期的形成、削弱其后期的分解与扩散，提高生物膜固定化效率和催化效率。
附图说明
[0031]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做更进一步的具体说明，本专利技术的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0032]图1为实施例1中motA、esaI、esaR、P
esaS
、P
esaR
‑
P
、mCherry、EGFP基因的琼脂糖凝胶电泳图。
[0033]图2为实施例1中OVERLAP后的esaI+esaR片段、P
esaS
+motA+mCherry片段及P
esaR
‑
P
‑
P+EGFP片段的琼脂糖凝胶电泳图。
[0034]图3为实施例1中构建重组的表达质粒示意图。
[0035]图4为实施例1中质粒转化菌落PCR示意图。
[0036]图5为实施例2中荧光显微镜结果示意图。
[0037]图6为实施例3中酶标仪检测荧光强度结果示意图。
[0038]图7为实施例4中结晶紫染色实验结果示意图。
[0039]图8为实施例5中L
‑
苏氨酸产量结果示意图。
具体实施方式
[0040]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0041]在以下所实施的方案当中，本专利技术所选用的大肠杆菌菌株是W1688，本专利技术所选用
的以铜绿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，向大肠杆菌W1688中导入含esaI/R系统的pUC19
‑
PJ23119
‑
MCS质粒，并将其与运动基因motA相结合。2.根据权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述esaI/R系统所含基因为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的转录调控因子：esaI、esaR；核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的启动子：P
esaS
、P
esaR
‑
P
；核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的报告基因：红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白EGFP。3.根据权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述运动基因motA的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。4.权利要求1～3中任意一项所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增得到esaI、esaR基因；以通用生物合成基因P
esaS
、P
esaR
‑
P
所在的PUC19质粒为模板扩增得到P
esaS
、P
esaR
‑
P
基因；以质粒pET28a
‑
mcherry为模板扩增得到mCherry基因；以质粒pET
‑
28a
‑
EGFP为模板扩增得到EGFP基因；(2)以步骤(1)所得片段为模板，通过overlap PCR扩增得到esaI+esaR片段、P
esaS
+motA+mCherry片段、P
esaR
‑
P
+EGFP片段；(3)将步骤(2)所得基因片段克隆到质粒pUC19
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PJ23119
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MCS的HindⅢ和SacⅠ两个酶切位点之间，得到重组质粒pUC19
‑
PJ23119
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MCS
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esaI/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；(4)将步骤(3)所得重组质粒转化到大肠杆菌T1感受态中，从大肠杆菌T1中进行重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，侯安奇，应汉杰，陈天鹏，孙文俊，余斌，柳东，牛欢青，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：