一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提供一种利用油脂为碳源的重组菌生产丁二酸。本发明专利技术提供的重组菌是以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为出发菌株，过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs、丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE和甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM，得到重组菌。本发明专利技术在一定程度上可以减轻丁二酸合成过程中对化石原料的依赖，符合国家“双碳战略”需求，具有广阔的发展前景及应用潜力。前景及应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用油脂合成丁二酸的重组菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]丁二酸是一种C4二元羧酸，是TCA循环的关键中间体。作为一种被广泛研究的高附加值化学品，丁二酸在农业、化工、医药和生物降解塑料等领域有着广泛的应用。丁二酸作为重要的平台化合物，可以转化为诸多工业化学品，如1,4
‑
丁二醇、丁二烯和四氢呋喃等。当前其市场潜力每年超过270万吨，产值超150亿美元/年。随着节能减排需求的倡导，当前越来越多的研究聚焦在丁二酸的生物制备中，以替代高耗能的化学合成过程。通过微生物代谢工程等手段，构建丁二酸生物合成菌株，以可再生资源作为发酵底物，促进工程菌株的生长和丁二酸的生产，这种方案逐步受到大家的重视。利用生物法进行丁二酸的制备具有明显优点，其原料来源广泛且价格低廉,污染小,环境友好,且在生产过程中能够利用CO2，一定程度上可以降低温室效应的影响，从而具有广阔的发展潜力。
[0003]油脂来源广泛，价格低廉，并且以油脂为碳源生成乙酰辅酶A的过程中，没有碳原子损失，较葡萄糖为碳源时，具备较高的碳原子经济性，但油脂为碳源时，难以被宿主细胞利用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了提供一种利用油脂为碳源的重组菌生产丁二酸。
[0005]本专利技术提供一种利用油脂合成丁二酸的重组菌，所述重组菌是以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为出发菌株，过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs、丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE和甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM，得到重组菌。
[0006]进一步地限定，所述的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC的不同亚基在NCBI中基因ID分别为accB:947758、accC:947761；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI中的蛋白质ID为AAS20429.1；丙酰辅酶A合酶Pcs在NCBI中的蛋白质ID为AAL47820.2；编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶McE在NCBI中的蛋白质ID为ACL23899.1；编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972。
[0007]进一步地限定，将丙酰辅酶A羧化酶PCC进行突变，将第220位的天冬酰胺突变为异亮氨酸，第391位的异亮氨酸突变为苏氨酸；将丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR进行突变，将第940位的天冬酰胺残基突变为缬氨酸残基，第1106位的赖氨酸残基突变为色氨酸残基，第1114位的丝氨酸残基突变为精氨酸残基。
[0008]本专利技术提供一种上述的重组菌在生产丁二酸中的应用。
[0009]本专利技术提供一种制备上述的重组菌的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
[0010]步骤1：利用pBBR1MCS
‑
1质粒过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs获得重组质粒1；
[0011]步骤2：利用pBBR1MCS
‑
4质粒过表达丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM获得重组质粒2；
[0012]步骤3：将步骤1和步骤2获得的获得重组质粒1和重组质粒2共转到真养产碱杆菌，得到重组菌。
[0013]本专利技术提供一种生产丁二酸的方法，所述方法的步骤如下：所述方法的步骤如下：将上述的重组菌置于含有油脂的培养基，发酵培养至少48小时。
[0014]进一步地限定，所述培养基的成分如下：油脂、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、酵母粉、碳酸氢钠、硫酸镁和微量元素。
[0015]进一步地限定，所述油脂为大豆油、花生油和棕榈油的任意一个或任意多个。
[0016]进一步地限定，所述培养基的成分如下：10g/L油脂、15.2g/L十二水合磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、0.5g/L酵母粉、1g/L碳酸氢钠、0.5g/L硫酸镁和0.1％(v/v)微量元素。
[0017]进一步地限定，所述微量元素为：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌中乙酰辅酶A羧化酶的accB与accC亚基在pBBR1MCS
‑
1质粒中共用同一个Plac启动子进行表达；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR的N端MCR
‑
N在pBBR1MCS
‑
4质粒中使用Plac,P2
‑
51启动子进行表达；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR的C端MCR
‑
C在pBBR1MCS
‑
4质粒中使用Plac启动子进行表达；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE与甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在pBBR1MCS
‑
4质粒中，共用同一个Plac启动子进行表达；丙酰辅酶A合酶的基因pcs在pBBR1MCS
‑
1质粒中使用Plac启动子进行表达；丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在pBBR1MCS
‑
4质粒中使用Plac启动子进行表达。
[0019]有益效果：本专利技术以真养产碱杆菌H16为宿主菌，通过过表达关键基因乙酰辅酶A羧化酶基因accBC、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr、丙酰辅酶A合酶基因pcs、丙酰辅酶A羧化酶基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM，获得工程菌。通过关键酶基因的表达调控，工程菌能够以油脂为唯一碳源，高效合成丁二酸。通过发酵优化，工程菌以棕榈油为碳源时，发酵48h，可以得到10.1g/L的丁二酸。
具体实施方式
[0020]下面通过实例来进一步阐明本专利技术。但本专利技术并不限于以下实施例。
[0021]下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
[0022]下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0023]所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，同源重组用的试剂盒为南京诺唯赞公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
[0024]培养基配方：
[0025]1)种子液摇瓶培养基
[0026]TSB培养基：15g/L胰蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl，其余为水，121℃，20min灭菌。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用油脂合成丁二酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为出发菌株，过表达乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC、丙酰辅酶A合酶的基因pcs、丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE和甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM，得到重组菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC的不同亚基在NCBI中基因ID分别为accB:947758、accC:947761；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI中的蛋白质ID为AAS20429.1；丙酰辅酶A合酶Pcs在NCBI中的蛋白质ID为AAL47820.2；编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶McE在NCBI中的蛋白质ID为ACL23899.1；编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，将丙酰辅酶A羧化酶PCC进行突变，将第220位的天冬酰胺突变为异亮氨酸，第391位的异亮氨酸突变为苏氨酸；将丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR进行突变，将第940位的天冬酰胺残基突变为缬氨酸残基，第1106位的赖氨酸残基突变为色氨酸残基，第1114位的丝氨酸残基突变为精氨酸残基。4.权利要求1
‑
3任意一项所述的重组菌在生产丁二酸中的应用。5.一种制备权利要求1或2所述的重组菌的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘修涛，熊鹏，商贺，刘哲，曹心彤，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：