一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用，包括如下步骤：S1、根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列，分别设计两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2，以及一条通用反向引物LSP；S2、分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列GC

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其应用。

技术介绍

[0002]等位基因多态性(Allelic Polymorphism，AP)广泛存在于各物种基因组中并与各种性状相关联，因此AP分型检测被广泛用于遗传疾病诊断，药物开发，作物育种及纯度鉴定等领域。等位基因特异扩增PCR(Allele Specific PCR，AS
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PCR)是用于AP分型的主要技术手段，通过设计三条引物，其中两条等基因特异引物(Allele Specific Primer，ASP)仅在3＇末端碱基存在差异(分别和对应的多态性位点互补)，共用一条等位基因通用反向引物(Locus Specific Primer，LSP)，在同一反应体系中进行PCR反应产生在AP位点存在差异的两种产物，通过鉴别这两种产物是否存在以完成样品的AP分型鉴定。使用基于荧光信号的AS
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PCR进行AP分型检测具有准确，快速，高通量，低成本，无污染，设备要求低及易操作的优势。通常来说，荧光信号的产生主要有两种方式：
[0003]一种方式是荧光探针法，目前已有多种类型的荧光探针用于AS
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PCR产物检测，大部分都是基于荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)原理，即在产物之前使探针的荧光基团和猝灭基团靠近而处于猝灭状态，产物出现之后通过探针和产物结合或者被水解的方式，导致荧光基团和猝灭基团分离，从而产生荧光信号。另一种方式是荧光染料法，荧光染料如SybrGreenI可以特异性的和双链DNA结合而产生荧光，将其添加在反应体系中，每次循环后检测荧光信号强度即可实时监控PCR反应的进程。
[0004]荧光染料法的成本虽然低于荧光探针法，但由于荧光染料和双链DNA是无差别结合，当反应体系中存在不同的双链DNA的时候，因此仅通过实时荧光信号无法在反应中对产物进行区分。由于荧光染料具有和双链DNA特异结合并发光而未结合时不产生荧光信号这一特性，在PCR反应结束后对反应体系进行升温处理，在升温至接近变性温度的过程中，双链DNA产物会逐步变性解离为单链，该过程中荧光染料同时逐渐解离而出现荧光信号逐渐减弱的现象，以这一过程中的荧光强度为Y轴，温度为X轴作图，即可获得该双链DNA的熔解曲线(Melting Curve，MC)，以及将这一过程中荧光强度和温度的单阶导数的相反数为Y轴，温度为X轴作图获得该双链DNA的导数熔解曲线(Derivative Melting Curves，DMC)，从DMC中可以获得一半双链DNA解离时的温度即熔解温度Tm(melting temperature,Tm)、熔解峰数量、位置和峰高等信息。不同双链DNA的DMC形态，Tm及熔解峰数量位置等均有差异，因此通过熔解曲线分析即可区分不同的双链DNA。K.M.Ririe等(Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.Analytical Biochemistry.1997；245(2):154
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60.)以SybrGreenI为荧光染料使用熔解曲线分析用于鉴别PCR产物，证实相同长度不同GC含量，相同GC含量不同长度，以及同长度同GC含量但不同GC分布的双链DNA均可以通过熔解曲线进行分辨。
[0005]熔解曲线分析可用于AP分型鉴定，但当等位基因之间差异极小时，例如单核苷酸
多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)或者数个碱基插入缺失多态性(Insertion
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Deletion，InDel)，等位基因特异扩增产物间熔解温度差异(ΔTm)极小。由于SybrGreenI在高浓度下会抑制PCR反应，因此只能在低浓度下使用，导致该染料无法结合在双链DNA的所有位置，在熔链升温的过程中从低熔点区域脱离的染料会重新结合在高熔点区域中尚未结合荧光染料的部分，即发生染料重排导致微量的荧光信号强度变化无法被检测到，或者含有多态性位点的区域未结合荧光染料导致该区域在解离前后荧光强度无变化。这可能会导致在纯合突变体分型鉴定中两种突变体的ΔTm过小而无法区分，或者在杂合突变体的分型鉴定中只产生一种熔解峰而导致被误判为纯合材料。虽然染料重排现象可以通过在PCR反应之后加入高浓度的SybrGreenI染料进行熔解曲线分析加以解决，但这会导致操作步骤增加且因为开盖而造成气溶胶污染。
[0006]高分辨率熔解曲线(High
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resolution Melting Curve，HRM)可以在单一封闭容器内通过熔解曲线分析完成微小差异等位基因分型，即双链DNA解离过程中温度增速低于0.1℃/秒，搜集数据点至少10个/℃。HRM测定可以使用荧光探针替代SybrGreenI，例如利用鸟嘌呤核苷酸能够猝灭荧光基团的特点，使用荧光基团标记的引物对目标DNA进行PCR扩增，获得带有荧光标记的DNA产物并进行HRM分析(C.N.Gundry et al.Amplicon melting analysis with labeled primers:a closed
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tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes.Clinical Chemistry.2003；49(3):396
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406.)；或者相对于需要特异设计且合成成本较高的荧光探针，使用其他荧光染料替代SybrGreenI进行HRM分析。
[0007]C.T.Wittwer等(High
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Resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen.Clinical Chemistry.2003；49(6):853
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60.)使用荧光染料LCGreen进行高分辨率熔解曲线分析，该染料在高浓度下不会抑制PCR反应，因此在熔解曲线测定过程中不会发生染料重排，从而实现在单一封闭容器中完成HRM测定。在基因分型工作中，同样的样品HRM获得的Tm值差异更大，并成功鉴定杂合样品。尽管HRM的分辨率较高，但不同基因型PCR产物GC含量差异极小时，如SNP样品中的G/C和A/T两种基因型，不一定能够取得较好的分型效果或者需要人工干预加以判断，如能在HRM基础上进一步增大多态性扩增产物之间的Tm值差异，则更有利于进行分型结果的准确判定，尤其是减少人为干预以实现高通量自动化判定。
[0008]S.Germer等(Single
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tube genotyping without oligonucleotide probes.Genome本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列，分别设计两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2，以及一条通用反向引物LSP；S2、分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列，并且所述特异性引物ASP1和ASP2的3＇末端碱基分别和待检测样品中的不同多态性位点匹配；S3、配制PCR反应体系，加入相应试剂后，进行AS
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PCR扩增反应；S4、扩增反应完成后，通过熔解曲线分析，即可完成对待检测样品基因分型鉴定。2.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述特异性引物ASP1和ASP2位于所述多态性位点的上游或位于所述多态性位点的下游。3.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述额外序列插入的位置距离所述特异性引物的3＇末端最短距离为10个碱基，最远可位于所述特异性引物的5＇末端。4.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述额外序列选自GC
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add或AT
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add中的一种。5.根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC
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add添加在所述特异性引物ASP1中，所述AT
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add添加在所述特异性引物ASP2中。6.根据权利要求5所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC
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add和所述AT
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add分别在所述特异性引物ASP1和ASP2上的插入位点和3＇末端碱基的距离相同或不同。7.根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC
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add和所述AT
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add的长度相同或不同。8.根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC
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add和所述AT
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add至少由如下物质中的一种组成：1)核苷酸碱基；2)核苷酸碱基类似物；3)化学修饰的核苷酸碱基。9.根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述GC
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add的长度为3～40bp，并且所述GC
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add中的鸟嘌呤碱基(G)和胞嘧啶碱基(C)所占比例不少于60％。10.根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述AT
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add的长度为3～40bp，并且所述AT
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add中的腺嘌呤碱基(A)和胸腺嘧啶碱基(T)所占比例不少于60％。11.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述PCR反应体系包括两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2、一条通用反向引物LSP、缓冲体系、DNA聚合酶、dNTPs、待检测样品DNA以及荧光染料。12.根据权利要求11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述荧光染料包括可以和双链DNA特异结合或嵌入结合并产生荧光信号的荧光染料。13.根据权利要求11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述待检测样品DNA包括双链DNA、单链DNA、线性DNA、环状DNA以及由RNA转录获得的cDNA。
14.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述熔解曲线分析过程中，用于双链DNA解链的升温过程中升温速率不低于1.5℃/分钟。15.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法，其特征在于，所述AS
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PCR扩增反应可在单管中进行，并且所述单管中可以同时进行两个以上靶基因的分型检测。16.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨燕宇，谭超，侯静，罗辉，赵建华，
申请(专利权)人：武汉市景肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：