一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用制造技术

本发明专利技术涉及动物疫病检测技术领域，具体公开一种LAMP

【技术实现步骤摘要】
一种LAMP
‑
Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用


[0001]本专利技术涉及动物疫病检测
，尤其涉及一种LAMP
‑
Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用。

技术介绍

[0002]鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum，MG)是一种引起鸡呼吸道感染疾病的支原体，不同菌株的感染性和致病性不同，感染后的主要临床表现为流鼻涕、流眼泪、咳嗽，严重时表现为呼吸困难或张口呼吸，可听到湿性啰音。而且鸡感染后一般是隐性带菌，因此，早期筛查是防治的关键。目前，常用的检测鸡毒支原体的方法包括酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)和实时荧光定量qPCR等，但是，上述检测方法均需要复杂的操作程度和昂贵的检测设备，限制了鸡毒支原体的快速筛查。
[0003]环介导等温扩增(LAMP)是2000年的一种恒温检测新方法，通常设计两对引物，即外引物(F3/B3)、内引物(FIP/BIP)，分别结合于目的片段上具有较高的特异性。同时，恒温扩增不需要变温循环，理论上一个水浴锅就可以完成实验。为了加快反应速度，还可在上下游内引物的两个组分之前设计两条环引物。因此，LAMP技术与PCR检测技术相比，具有反应快速、设备低廉、操作简单、特异性高等优点。近年来，LAMP恒温检测技术被广泛地应用于食品、微生物、病原体的检测中。
[0004]但是，LAMP检测技术依然具有制约其发展的限制条件，如：扩增片段大小不一电泳结果无法直观看到，且引物数量越多，引物错配的概率越高，越容易造成非特异性扩增，产生假阳性结果，以及检出限较高，无法对鸡毒支原体进行早期检测。因此，急需发展一种简便、高特异性、高灵敏度的鸡毒支原体的快速检测方法。

技术实现思路

[0005]针对现有鸡毒支原体的检测方法存在的假阳性概率高、检出限高等问题，本专利技术提供一种LAMP
‑
Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用，利用该检测鸡毒支原体的引物和探针可在62
‑
64℃恒温条件下快速检测鸡毒支原体，且特异性好、灵敏度高，更有利于实现对鸡毒支原体的早期检测，实现疾病的早发现早治疗，有助于预防疾病的扩散。
[0006]为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：
[0007]一种LAMP
‑
Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针，包括：
[0008]内引物FIP：5
′‑
CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA
‑3′
(SEQ ID NO:1)；
[0009]内引物BIP：5
′‑
GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT
‑3′
(SEQ ID NO:2)；
[0010]外引物F3：5
′‑
CTGAACCAAAGCCAAATCC
‑3′
(SEQ ID NO:3)；
[0011]外引物B3：5
′‑
GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT
‑3′
(SEQ ID NO:4)；
[0012]环引物LF：5
′‑
GGAGGGTTTGGCATCGGATC
‑3′
(SEQ ID NO:5)；
[0013]环引物探针LBP：5
′‑
AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA
‑3′
(SEQ ID NO:6)。
[0014]相对于现有技术，本专利技术提供的LAMP
‑
Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针，可以特异性结合到鸡毒支原体的核酸上，准确检测出鸡毒支原体，且通过将下游环引物LB设计为环引物探针LBP，不但减少了非特异性扩增，降低了假阳性的概率，还提高了鸡毒支原体的检测效率和灵敏度。本专利技术提供的引物和探针，与鸡滑液囊支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9、禽流感病毒H5等21种病原体均无交叉扩增反应，特异性显著增强；且上述引物和探针的灵敏度高，对鸡毒支原体的最低检测限为0.258fg/μL，能够实现对鸡毒支原体的早期快速诊断，同时，检测的准确度高，用时短，在63℃恒温条件下快速扩增，仅需45min就可以达到检测水平，检测时间明显缩短，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在非实验室条件下快速检测鸡毒支原体病毒的目的，对鸡毒支原体的疫病防控具有重要意义，具有较高的实用价值。
[0015]优选的，所述环引物探针LBP的5
′
端标记有荧光基团，3
′
端标记有淬灭基团。
[0016]优选的，所述环引物探针LBP为：5
′‑
FAM
‑
AGCAGCTGCTAAAACAGCT TTGA
‑3′
BHQ。
[0017]本专利技术还提供了上述任一项所述的引物和探针在非诊断性检测鸡毒支原体中的应用。
[0018]本专利技术还提供了一种用于检测鸡毒支原体中的试剂盒，包含上述任一项所述的引物和探针。
[0019]优选的，所述试剂盒还包括基础缓冲液、氯化钾溶液、硫酸铵溶液、吐温20、DNA聚合酶、甜菜碱、硫酸镁溶液、dTNPs和去离子水。
[0020]进一步优选的，所述基础缓冲液为Tris
‑
HCl。
[0021]进一步优选的，所述DNA聚合酶包括Bst DNA polymerase large fragment和Taq DNA polymerase。
[0022]本专利技术还提供利用上述试剂盒检测鸡毒支原体的方法，具体操作为：提取鸡毒支原体的核酸为模板，用所述试剂盒进行LAMP扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
[0023]若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为鸡毒支原体阳性；若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为鸡毒支原体阴性。
[0024]上述检测鸡毒支原体的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，可用于鸡毒支原体的快速检测。
[0025]优选的，所述LAMP扩增的体系包括以下试剂及用量：pH8.8Tris
‑
HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH4)2SO
4 10mmol，吐温20 0.024μL，Bst DNA polymerase large fragment 8U，Taq DNA polymerase 5U，甜菜碱1mol，MgSO
4 8mmol，dNTPs 1.6mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LAMP
‑
Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针，其特征在于，包括：内引物FIP：5
′‑
CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA
‑3′
；内引物BIP：5
′‑
GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT
‑3′
；外引物F3：5
′‑
CTGAACCAAAGCCAAATCC
‑3′
；外引物B3：5
′‑
GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT
‑3′
；环引物LF：5
′‑
GGAGGGTTTGGCATCGGATC
‑3′
；环引物探针LBP：5
′‑
AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA
‑3′
。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述环引物探针LBP的5
′
端标记有荧光基团，3
′
端标记有淬灭基团。3.如权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述环引物探针LBP为：5
′‑
FAM
‑
AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA
‑3′
BHQ。4.权利要求1
‑
3任一项所述的引物和探针在非诊断性检测鸡毒支原体中的应用。5.一种用...

【专利技术属性】
技术研发人员：董振国，时国强，刘昱，焦义然，石磊，
申请(专利权)人：河北三狮生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：