体外培养富集人NK细胞的方法技术

本发明专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养NK细胞的方法，更具体地，本发明专利技术涉及一种使用刺激物组合从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增NK细胞的方法。本发明专利技术的技术方案成分简单、操作简便，获得的NK细胞比例高、增殖多、状态好。状态好。

【技术实现步骤摘要】
体外培养富集人NK细胞的方法


[0001]本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养富集人NK细胞的方法，更具体地，本专利技术涉及一种使用刺激物从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增NK细胞的方法。

技术介绍

[0002]2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。根据中国医学科学院肿瘤医院、国家癌症中心赫捷院士、全国肿瘤登记中心主任陈万青教授等在《CA:A Cancer Journal for Clinicians》杂志发表的《2015年中国癌症统计数据》：2015年我国肿瘤新发病例为429.2万。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50％，达到每年2160万人(Chen W,Zheng R,Baade P D,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2016,66:118.)。赫捷院士于2022年报道的2016年中国癌症发病率和死亡率显示，2016年新发病例406.4万，总死亡人数241.4万。(Zheng R,Zhang S,Zeng H,et al.Cancer incidence and mortality in China,2016[J].Journal of the National Cancer Center,2022,5:3
‑
4.)。美国癌症协会和国际癌症研究机构2021年联合在《CA:A Cancer Journal for Clinicians》杂志发布的2020年全球癌症统计分析提出，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中中国新发癌症456万人，占全球23.7％；全球死亡病例996万例，其中中国癌症死亡人数290万，占癌症死亡总人数29％，癌症死亡人数位居全球第一(Bray F,Sung H,Ferlay J,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in 185 countries.[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021,71:212.)。
[0003]针对肿瘤，传统的手术切除、化疗、放射线治疗，对正常组织有伤害，具有局限性，效果有限。近年来出现的靶向疗法在细胞分子水平上针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来与之结合并发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞。但分子靶向药物存在以下问题：有效性低，某种药物只能对特定突变基因型肿瘤产生作用；在肿瘤基因突变产生药物耐受性的情况下靶向药物的长期治疗效果下降；可能引起严重的不良反应；部分肿瘤不能通过靶向药物得到有效治疗。
[0004]而免疫疗法恰恰能够解决上述问题。当免疫系统由于自身或肿瘤细胞原因而削弱时，为肿瘤的发生提供有利条件；肿瘤免疫治疗通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤能力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤
‑
免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。
[0005]2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。自2013年以来，免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了一定成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。
[0006]随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。细胞免疫治疗是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。
[0007]肿瘤免疫细胞治疗已经经历了近30年的历史，从20世纪80年代以美国NIH肿瘤研究所的Rosenberg团队发现的IL
‑
2刺激第一代淋巴因子激活的LAK细胞(lymphokine activated killer cells，淋巴因子激活的杀伤细胞)治疗恶性黑色素瘤开始，到第二代细胞因子诱导的CIK细胞(Cytokine Induced Killer Cell，细胞因子激活的杀伤细胞)和自然杀伤细胞NK，以及第三代优化的DC
‑
CIK细胞(树突状细胞
‑
细胞因子激活的杀伤细胞)和TIL细胞(肿瘤浸润性淋巴细胞)，直到当前受到热捧的靶向性明确的嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T)和TCR工程化T细胞(TCR
‑
T)。
[0008]NK细胞即自然杀伤细胞，是天然免疫系统的核心细胞，是机体对抗肿瘤和病毒感染的第一道免疫防线，同时参与机体免疫调节功能。有别于适应性免疫系统的特异性杀伤，NK细胞不针对任何特异性肿瘤标志物，而是通过肿瘤共有的一些特征进行识别，如MHC
‑
I受体下调和表达损伤相关蛋白，因此基于NK细胞开发出的细胞治疗药物具有广谱适应性。在识别到肿瘤细胞后，无需免疫系统指令，也无需其他免疫细胞配合，NK细胞可以第一时间独立迅速的进行直接杀伤。
[0009]基于以上优点，多种来源的NK细胞已被应用于肿瘤的免疫治疗，包括自体来源，异体来源，细胞系来源，脐带血来源和iPSC来源等等。
[0010]已开展的临床研究中，NK细胞在血液瘤的临床应用最多，多个针对急性髓系白血病的临床研究都观察到了明确的临床效果，总体反应率能达到50％以上，有部分患者可达完全缓解(CR)。其他血液肿瘤，如多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤，以及部分实体瘤也观察到不错的临床效果，更重要的是，NK细胞疗法的安全性高，几乎没有观测到任何移植物抗宿主反应(GVHD)和相关毒性。
[0011]NK细胞功效明确并且安全性高，很早就获得临床研究者的青睐，但如何获得足够数量的满足临床需求的NK细胞一直是困扰研究者的难题。早期的主流方法是使用丝裂霉素处理或者辐照灭活的饲养层细胞共同培养，其优点是扩增效果好，能够满足临床应用需要，然而丝裂霉素轻微残留可能在后续的临床应用中对人体产生不良影响，而辐照方式使用便利性差，不易扩展，而且未被完全处理的饲养细胞在后续应用中始终是一种隐患。后期随着研究的深入，越来越倾向使用纯细胞因子的方法进行培养。IL
‑
2(白细胞介素
‑
2)是应用最多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养富集人NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从人外周血中分离PBMC；2)对所述PBMC进行磁性分选，获得去除了T淋巴细胞的CD3阴性细胞悬液；3)将所述细胞悬液在预包被有CD16抗体的细胞培养瓶中，使用含0
‑
15％人体自身血浆的淋巴细胞无血清培养基培养，获得目的NK细胞悬液，预包被中使用的所述CD16抗体的浓度为5
‑
20μg/mL，所述培养基中含有浓度为100
‑
2000IU/mL的IL
‑
2、浓度为10
‑
100ng/mL的IL
‑
15、浓度为10
‑
100ng/mL的IL
‑
18、浓度为10
‑
100ng/mL的IL
‑
21。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在培养的第0天至第5天中补加与第0天培养体系等体积的活化培养基进行培养，在培养的第5天至培养结束，每2
‑
3天根据细胞总数补加扩增培养基进行培养，每次补加扩增培养基，使得细胞密度维持在0.5
×
106/mL
‑1×
106/mL，所述活化培养基为含有浓度为100
‑
2000IU/mL的IL
‑
2、浓度为10
‑
100ng/mL的IL
‑
15、浓度为10
‑
100ng/mL的IL
‑
18、浓度为10
‑
100ng/mL的IL
‑
21的含5
‑
10％的人体自身血浆的淋巴细胞无血清培养基，所述扩增培养基为仅含有浓度为100
‑
2000IU/mL的IL
‑
2作为细胞因子的含人体自身血浆的淋巴细胞无血清培养基，其中，所述扩增培养基中第0天至第7天含5
‑
10％的人体自身血浆，第7天起含0
‑
2％的人体自身血浆。3.根据权利要求2所述的方法，其中，在培养的第3天至第5天补加所述活化培养基。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，培养时间为10～20天，优选为12
‑
16天。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述活化培养基中含有浓度为500
‑
1500IU/mL的IL
‑
2、浓度为10
‑
30ng/mL的IL
‑
15、浓度为30
‑
70ng/mL的IL
‑
18、浓度为30
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫红，靳文静，陈瑜，牟颖慧，
申请(专利权)人：北京中科微源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：