本发明专利技术提供了一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法，涉及基因工程技术领域，所述试剂包括穿膜肽DLR8与脂质体混合物，试剂中穿膜肽DLR8：脂质体的质量比为4～8.8:1。所述HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法中，选择穿膜肽DLR8与脂质体混合物作为HEK293细胞瞬时表达的转染试剂，高糖DMEM培养基作为转染孵育Buffer，并在细胞转染处理后48h进行细胞悬浮，添加小分子添加剂丁酸钠，提高了HEK293细胞外源蛋白的表达水平，使得目的基因可高效表达。使得目的基因可高效表达。使得目的基因可高效表达。
【技术实现步骤摘要】
一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法
[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法。
技术介绍
[0002]全球医药产业中生物药物的市场比重不断扩大，市场规模也稳步增长。其中重组蛋白质(包括抗体)药物的生产是生物制药的一个重要部分。在2018年，全球生物药物市场规模已高达2618亿美元，其中单抗药物为1448亿美元(占比高达55.3％)。细菌、酵母、昆虫细胞都可以作为重组蛋白药物表达的宿主细胞，但由于哺乳动物细胞具有类似人类细胞的翻译后加工修饰(post
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translational modifications，PTMs)，已经成为目前重组蛋白生产的重要平台。2015～2018年新批准上市的重组抗体，79％来源于哺乳动物细胞。尽管经FDA批准上市的重组蛋白质(抗体)药物大都是由CHO细胞生产的，但CHO细胞系中诸多的糖基化方式与人源细胞不尽相同，产生的重组蛋白仍可能有一定的免疫原性。HEK293作为人源化的细胞系，表达重组蛋白药物与来源于人的蛋白具有完全一致的PTMs，具有不会引起免疫反应等优点。
[0003]目前哺乳动物细胞生产的最耗时的方法是建立稳定的细胞系，而瞬时表达系统(transient gene expression，TGE)无需进行复杂和长时间的筛选步骤，仅通过一个批次的培养就可以收获目的蛋白。瞬时表达系统高效率特点使得在快速获得流感检测抗体、筛选大量蛋白候选药物以及个体化小规模蛋白药物生产等方面具有无可替代的优势。在TGE系统中，通过瞬时转染的方法将携带目的基因的质粒直接转入细胞驱动重组蛋白的生产。转染后，包含目的基因的质粒(pDNA)基本不与细胞中染色体基因组DNA发生整合，直接进行重组蛋白的转录和翻译过程。细胞在分批培养过程中，细胞中的质粒随着细胞的分裂而被稀释，并在连续的几轮细胞分裂中丢失。典型的表达窗口是在质粒完全丢失前，转染后的24～96h。通常7天左右就可以完成一轮瞬时表达蛋白的收获。提高TGE的性能就需要从TGE系统中涉及的过程入手进行优化，包括但不限于针对递送试剂、转染方式、转染条件、表达载体、培养工艺的优化和培养基等的优化。瞬时表达系统单位体积产量与稳定哺乳动物细胞株的单位体积产量差距较大，这也是大规模基因瞬时表达技术所面临的最大瓶颈。为了改善这一现状，对TGE系统进行优化是目前研究的一个重点。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法，能更好的提高HEK293细胞外源蛋白表达水平，高效表达目的基因。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂，所述试剂包括穿膜肽DLR8与脂质体混合物，试剂中穿膜肽DLR8：脂质体的质量比为4～8.8:1。
[0007]优选的，所述HEK293细胞瞬时表达转染用试剂中，穿膜肽DLR8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第1、3、5位氨基酸为D
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精氨酸。
[0008]本专利技术还提供了所述HEK293细胞瞬时表达转染用试剂的转染方法，包括以下步骤：
[0009](1)将穿膜肽DLR8、包含目的基因的质粒、脂质体分别与孵育Buffer混合，孵育3～7min；然后，将穿膜肽DLR8孵育物与脂质体孵育物混合，再孵育8～12min获得转染试剂孵育物；将所述转染试剂孵育物与包含目的基因的质粒孵育物，混合，孵育8～12min，得转染复合物；
[0010](2)将所述转染复合物滴加到HEK293细胞中，静置培养6～8h后更换培养基，再继续培养24～48h，完成细胞转染；
[0011](3)细胞转染处理24～72h后，将细胞接种于293细胞无血清培养基，进行悬浮培养。
[0012]优选的，步骤(1)中采用的孵育Buffer为高糖DMEM溶液。
[0013]优选的，步骤(1)转染复合物中包含目的基因的质粒的浓度为1.2～2.0μg/mL，脂质体的浓度为3～5μL/mL。
[0014]优选的，步骤(1)转染复合物中，穿膜肽DLR8与包含目的基因的质粒的质量比为1:2～4。
[0015]优选的，步骤(2)中滴加的转染复合物用量与细胞密度的比例为1.25～5mL：1～4
×
105。
[0016]优选的，步骤(2)中更换所用培养基为高糖DMEM完全培养基。
[0017]优选的，步骤(2)中静置培养的温度为37℃，CO2的体积分数为3～7％。
[0018]优选的，步骤(3)进行悬浮培养过程中，加入1～3mM的丁酸钠。
[0019]本专利技术的技术效果和优点：
[0020]本专利技术提供了一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂和瞬时表达系统转染方法，本专利技术中选择穿膜肽DLR8与脂质体混合物作为HEK293细胞瞬时表达的转染试剂，高糖DMEM培养基作为转染孵育Buffer，并在细胞转染处理后48h进行细胞悬浮，添加小分子添加剂丁酸钠，提高了HEK293细胞外源蛋白的表达水平，使得目的基因可高效表达。
附图说明
[0021]图1为多肽凝胶阻滞电泳图；
[0022]图2为CPP
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pDNA模式介导的基因递送图(A：不同剂量DLR8使用下DLR8
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pDNA模式介导的EGFP表达48h荧光图；B：不同剂量CPPMK2使用下CPPMK2
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pDNA模式介导的EGFP表达48h荧光图；C：对图2ADLR8
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pDNA转染效率统计分析的结果；D：对图2B CPPMK2
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pDNA转染效率统计分析的结果)；
[0023]图3为DLR8
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pDNA模式介导的基因递送图(A：DLR8
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pDNA模式在更大DLR8剂量范围内的测试结果；B：DLR8
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pDNA在最佳工作范围内对细胞无毒性；C：凝胶阻滞验证DLR8溶液在4℃保存3个月后对DNA的阻滞能力)；
[0024]图4为不同转染孵育Buffer转染效率对比(A：实验组EGFP的荧光图B：转染效率统计分析柱形图)；
[0025]图5为不同悬浮培养基性能测试(A：不同悬浮培养基分批培养SEAP的体积产量；B：不同悬浮培养基活细胞密度与细胞活率)；
[0026]图6为不同pDNA(包含目的基因的质粒)浓度转染SEAP表达量；
[0027]图7为转染后不同时间悬浮eGFP、SEAP表达水平；(A：不同悬浮时间48h EGFP荧光图；本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种HEK293细胞瞬时表达转染用试剂，其特征在于，所述试剂包括穿膜肽DLR8与脂质体混合物，试剂中穿膜肽DLR8：脂质体的质量比为4～8.8:1。2.如权利要求1所述HEK293细胞瞬时表达转染用试剂，其特征在于，所述穿膜肽DLR8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第1、3、5位氨基酸为D
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精氨酸。3.权利要求1所述HEK293细胞瞬时表达转染用试剂的转染方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将穿膜肽DLR8、包含目的基因的质粒、脂质体分别与孵育Buffer混合，孵育3～7min；然后，将穿膜肽DLR8孵育物与脂质体孵育物混合，再孵育8～12min获得转染试剂孵育物；将所述转染试剂孵育物与包含目的基因的质粒孵育物，混合，孵育8～12min，得转染复合物；(2)将所述转染复合物滴加到HEK293细胞中，静置培养6～8h后更换培养基，再继续培养24～48h，完成细胞转染；(3)细胞转染处理24～72h后，将细胞接种于293细胞无血清培养基，进行悬浮培养。4.如权利要求3所述HEK293细胞瞬时表达的转染方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，马凯，米春柳，张俊河，耿少军，耿少雷，
申请(专利权)人：北京同立海源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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