一种大肠杆菌重组表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌重组表达载体及其应用。本发明专利技术的表达载体，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其在构建时，是将InaXn冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白和plCSA

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌重组表达载体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌重组表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]胎盘样硫酸软骨素A(plCSA)为附着至蛋白聚糖的、交替的氨基糖和己糖醛酸残基的直链聚合物，已有研究证实plCSA广泛地在胎盘滋养细胞上表达。此外，研究证实，表达疟疾蛋白VAR2CSA的恶性疟原虫只粘附在胎盘上，VAR2CSA通过介导受恶性疟原虫感染的红细胞与合体滋养细胞表面的plCSA结合从而聚集在胎盘。可见，疟疾蛋白VAR2CSA可以特异性地与PLCSA结合。于是有研究者通过噬菌体筛选方法鉴定了来自VAR2CSA的最小plCSA结合区的肽，然后通过组织学分析证明了其靶向性，并将其命名为胎盘硫酸软骨素A结合肽(plCSA
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BP)。因此，采用plCSA
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BP制备的纳米粒子未来有望用作针对人类胎盘滋养细胞的靶向药物的工具。
[0003]小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)是一种靶向核酸的治疗药物。与小分子和单克隆抗体药物相比，siRNA有一个天然优势。小分子和单克隆抗体药物通常是依靠识别对应蛋白质复杂的空间构象来发挥作用。由于多数蛋白质的空间构象难以匹配吻合度高的小分子和单克隆抗体药物，以至于很多疾病都无法通过该类药物治疗。而siRNA是凭借与mRNA完全碱基互补配对的方式发挥作用。于是从理论上讲，siRNA可通过序列特异性的特点靶向沉默任何致病基因，以此对多种疾病都可以进行精准靶向治疗。但是siRNA药物所具有的一些致命缺点又极大地限制了其临床应用。例如裸露的siRNA极易被降解难以通过血液循环到达靶细胞、游离的siRNA很难进行跨膜运输、siRNA的有义链(或过客链)导致的脱靶效应等。为了清除上述障碍，让siRNA药物真正发挥出价值，相关学者致力于对siRNA进行各种化学修饰并开发出大量的递送系统，目前构建了包括脂质体、聚合物、细胞外膜囊泡、无机纳米颗粒、肽类大分子等递送载体。
[0004]在上述递送载体中，细菌外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)凭借粒径小、稳定、生物相容性好等优点成为一种理想的药物递送载体。细菌外膜囊泡是革兰氏阴性菌分泌的一种直径为30
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200nm的球形纳米囊泡，属于磷脂双分子层蛋白脂质体，它在细菌的生命活动中发挥着重要作用，能够保护细菌免受有害物质侵害、调节细菌生物膜的形成、介导细菌间的交流等。
[0005]目前，工程化OMVs在靶向递送系统领域已经有不少研究，但是针对载siRNA胎盘靶向的工程化OMVs，现有技术中并未见相关报道。因此，如何制备并成功构建得到产率高、特异性强、安全性好，能够有效载siRNA的胎盘靶向的工程化OMVs，从而有效促进胎盘病变相关疾病治疗药物的开发，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]基于以上目的，本专利技术的目的之一在于提供一种大肠杆菌重组表达载体，其能够分泌在表面表达目标蛋白plCSA
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BP的细菌外膜囊泡(OMVs)，并且产率高，胎盘靶向性好，能
够有效作为siRNA载体。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供一种大肠杆菌重组表达载体在生产细菌外膜囊泡中的应用，生产所得细菌外膜囊泡是一种具有安全性和靶向性、能够有效保护siRNA的OMVs载体。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术的大肠杆菌重组表达载体，采用如下技术方案实现：
[0009]一种大肠杆菌重组表达载体，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述大肠杆菌重组表达载体在构建时，是将InaXN冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白和plCSA
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BP目标蛋白的编码基因构建成重组质粒后，转入减毒大肠杆菌得到。
[0010]InaXN冰核蛋白为冰核蛋白N末端结构域蛋白，sfGFP为超折叠绿色荧光蛋白(super fold Green fluorescent protein)。本专利技术通过前期研究证实，采用InaXN冰核蛋白作为铆钉蛋白，可将sfGFP绿色荧光蛋白和pICS
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BP目标蛋白有效融合表达在细胞膜上。
[0011]基于此，本专利技术利用基因工程技术设计了一种能够分泌具有安全性和靶向性OMVs载体的大肠杆菌重组表达载体，其含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，开放阅读框序列全长1326bp，依次编码InaXN冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白、pICS
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BP目标蛋白。其中1～528bp位点处为InaXN冰核蛋白编码基因(528bp)，529
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1242bp位点处为sfGFP绿色荧光蛋白编码基因(714bp)，1243～1326bp位点处为pICS
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BP目标蛋白编码基因(84bp)。
[0012]为了使目标蛋白plCSA
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BP稳定表达于大肠杆菌以及OMVs表面，并有效提高OMVs的表达量，本专利技术通过将plCSA
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BP与InaXN冰核蛋白融合表达，并连接sfGFP作为指示蛋白，使得OMV表达量提高，并且具有绿色荧光可以在显微镜下被示踪，同时，表达得到OMV的既具有优于脂质体的特点，同时有更好的稳定性、生物相容性、安全性以及胎盘靶向性，是一种能有效保护siRNA的载体，能够有效促进胎盘病变相关的疾病治疗药物的开发，具有良好的临床应用价值。
[0013]基于安全性的首要考虑，本专利技术采用的减毒大肠杆菌，为预先敲除了msbB基因的大肠杆菌。具体操作时，可采用CRISPR法敲除大肠杆菌msbB基因。本专利技术通过实验证实，通过msbB基因的预先敲除，能够有效降低表达产物的毒性，更利于产物安全性的提高。
[0014]本专利技术的另一方面在于提供一种大肠杆菌重组表达载体在生产细菌外膜囊泡中的应用，所述细菌外膜囊泡的表面表达有plCSA
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BP目标蛋白。
[0015]采用本专利技术的大肠杆菌重组表达载体，能够生产表达得到含有plCSA
‑
BP蛋白的细菌外膜囊泡，实验证实，本专利技术生产的OMVs内毒素值低，表达量高，是一种更加安全的OMVs载体。并且，OMVs稳定性好，有利于长期保存，是一种兼具胎盘靶向性、安全性的载siRNA天然生物载体。
[0016]产物的表达同时受培养温度、培养时间和诱导剂的多重影响。本专利技术在进行诱导剂、温度、时间筛选后，选择大肠杆菌重组表达载体生产细菌外膜囊泡的诱导表达的条件为：含有0.1～1mM的异丙基β
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D
‑1‑
硫代吡喃半乳糖苷的LB液体培养基，20～30℃条件下诱导4～14h。
[0017]为进一步提高产物表达量，更优选地，所述大肠杆菌重组表达载体诱导表达的条件为：含有1mM的异丙基β
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D
‑1‑
硫代吡喃半乳糖苷的LB液体培养基，30℃条件下诱导14h。
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌重组表达载体，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述大肠杆菌重组表达载体在构建时，是将InaXN冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白和plCSA
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BP目标蛋白的编码基因构建成重组质粒后，转入减毒大肠杆菌得到。2.如权利要求1所述的大肠杆菌重组表达载体，其特征在于，所述减毒大肠杆菌为预先敲除了msbB基因的大肠杆菌。3.一种如权利要求1所述的大肠杆菌重组表达载体在生产细菌外膜囊泡中的应用，其特征在于，生产所得细菌外膜囊泡的表面表达有plCSA
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BP目标蛋白。4.如权利要求3所述的大肠杆菌重组表达载体在生产细菌外膜囊泡中的应用，其特征在于，所述大肠杆菌重组表达载体在生产细菌外膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，高兴丽，李淑丽，郭永然，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：