一种蜜蜂抗菌肽的基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种蜜蜂抗菌肽及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。通过高密度液体发酵进行高效表达，制备出作为饲料添加剂的蜜蜂抗菌肽AP2，代替饲用抗生素，防治动物疾病，克服抗生素滥用带来的不良后果，并降低生产成本。并降低生产成本。并降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种蜜蜂抗菌肽的基因及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种蜜蜂抗菌肽及其基因和应用。

技术介绍

[0002]抗生素在治疗疾病、预防感染、促进动物生长、改善动物健康状况等方面发挥了十分积极的作用，但其危害也被各国所重视，在饲料及养殖中禁用抗生素的呼声越来越高。抗生素在环境中的污染，会使一些致病菌产生抗药性，甚至造成超级病菌的产生，这会对人类社会产生巨大的危害和风险。因此，抗生素的替代成为国内外急待解决的一个重大问题。
[0003]抗微生物肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)是生物体免疫系统在受到异源刺激时，诱导产生的一类防御性生物活性肽，是机体非特异性天然防御系统的重要组成部分，广泛存在于自然界各种生物以及人体内。
[0004]抗菌肽为一种多肽类物质，对动物机体没有毒害作用，易被降解，不会对环境造成污染、残留，可作为畜禽饲料添加剂取代或部分取代目前饲喂动物所用的抗生素，减少抗生素对动物体的危害。
[0005]蜜蜂属于膜翅目昆虫，没有严格意义上的免疫应答机制，当受到外界致病菌的侵入时，其血淋巴内即会产生抗菌肽，用于抵御疾病的发生，属于非特异性免疫。
[0006]通过现代生物技术方法，工业化生产对病原菌具有专一性或特异性的抗菌肽产品，是开发饲用抗生素替代产品的一条重要而有效的途径。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种蜜蜂抗菌肽AP2。
[0008]本专利技术的另一目的是提供编码上述蜜蜂抗菌肽AP2的基因Kap。
[0009]本专利技术的另一目的是提供包含编码上述蜜蜂抗菌肽AP2基因Kap的重组载体。
[0010]本专利技术的另一目的是提供包含上述蜜蜂抗菌肽AP2基因Kap的重组菌株。
[0011]本专利技术的另一目的是提供制备上述蜜蜂抗菌肽AP2的方法。
[0012]本专利技术的另一目的是提供上述蜜蜂抗菌肽AP2的应用。
[0013]本专利技术的来源于蜜蜂的抗菌肽AP2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
[0014]RVRRPVYIPQPRPPHPRL
[0015]该抗菌肽共由18个氨基酸残基组成，分子量为2235Da。
[0016]本专利技术的编码上述蜜蜂抗菌肽AP2的基因Kap的序列如SEQ ID NO:2所示：
[0017]5’‑
ATGAGGGTAAGACGACCAGTCTATATACCTCAGCCCCGCCCTCCGCACCCACGGCTATGA
‑3’
[0018]该基因进行毕赤酵母密码子偏好优化，并且在5
’
及3
’
端分别加上EcoR I及Not I酶切位点后，合成后的基因序列如SEQ ID NO:3所示：
[0019]5’‑
GAATTCATGAGGGTAAGACGACCAGTCTATATACCTCAGCCCCGCCCTCCGCACCCACGGCTATGAGCGGCCGC
‑3’
。
[0020]本专利技术提供了包含上述蜜蜂抗菌肽基因Kap的重组载体，载体优选为pPICZαA，将
Kap采用EcoR I和Not I进行双酶切，然后插入到经同样双酶切得到的pPICZαA载体中，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，优选得到重组载体Kap
‑
pPICZαA。
[0021]本专利技术还提供了包含上述重组载体Kap
‑
pPICZαA的重组菌株，表达宿主优选为毕赤酵母X33。
[0022]本专利技术还提供了一种工业制备蜜蜂抗菌肽AP2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0023]1)用上述重组载体Kap
‑
pPICZαA转化宿主细胞，得到重组菌株；
[0024]2)培养重组菌株，诱导蜜蜂抗菌肽AP2的表达；以及
[0025]3)采用喷雾干燥法进行后处理，得到最终产品。
[0026]本专利技术还提供了上述蜜蜂抗菌肽AP2的应用，优选其作为饲料添加剂应用于饲料及养殖行业。
[0027]本专利技术合成蜜蜂抗菌肽基因，构建毕赤酵母重组工程菌株，通过高密度液体发酵进行高效表达，制备出作为饲料添加剂的蜜蜂抗菌肽AP2，代替饲用抗生素，防治动物疾病，克服抗生素滥用带来的不良后果，并降低生产成本。蜜蜂抗菌肽AP2效价检测结果显示，AP2除对弧菌无明显抑制效果外，对多种细菌均有效果，尤其是对金黄色葡萄球菌效果最佳。高温处理对AP2抗菌性能的影响很小，AP2耐高温性能非常优良。蜜蜂抗菌肽AP2抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的性能良好，AP2具有作为饲料添加剂使用的优势，产品应用时在动物胃肠道中不会被消化酶水解。
附图说明
[0028]图1显示蜜蜂抗菌肽AP2生产菌株的筛选结果；
[0029]图2为Kap
‑
pPICZαA
‑
X33在50L罐中高密度液体发酵曲线。
具体实施方式
[0030]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0031]实验材料和试剂：
[0032]1、菌株与载体
[0033]大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、土拉弗朗西斯菌、副溶血弧菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、链球菌均由市售购得，毕赤酵母X33、载体pPICZαA购自Invitrogen公司。
[0034]2、酶与试剂盒
[0035]DNAMarker、博莱霉素(Zeocin)、胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒等购自上海生工公司。限制性内切酶EcoR I与Not I、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa(大连宝生物工程有限公司)。Sac I购自NEB公司(中国)。胃蛋白酶、胰蛋白酶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
[0036]3、培养基
[0037]BSM发酵培养基(基础盐培养基，Basal Salts Medium)：85％磷酸26.7mL，二水硫
酸钙0.9g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，微量元素(PTM1)4.4mL，加水定容至1L。
[0038]微量元素PTM1：七水硫酸亚铁65g，五水硫酸铜6g，碘化钠0.08g，一水硫酸锰3.0g，氯化钴0.5g，氯化锌20g，硼酸0.02g，二水钼酸钠0.2g，生物素0.2g，98％浓硫酸5mL，采用纯净水定容至1L。其中生物素于PTM1高温灭菌并冷却至室温后加入。
[0039]实施例1、蜜蜂抗菌肽的提取、纯化及测序
[0040](1)蜜蜂抗菌肽的提取：将100只左右中华蜜蜂(Apis cerana)烘干、粉碎后，采用80％的甲醇溶液进行提取，在常温下提取条件如下：甲醇与蜜蜂干粉用量：6：1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜜蜂抗菌肽AP2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种蜜蜂抗菌肽基因Kap，其特征在于，编码权利要求1所述的蜜蜂抗菌肽AP2。3.根据权利要求2所述的蜜蜂抗菌肽基因Kap，其特征在于，所述蜜蜂抗菌肽基因Kap的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。4.包含权利要求2所述蜜蜂抗菌肽基因Kap的重组载体。5.包含权利要求2所述蜜蜂抗菌肽基因Kap的重组菌株。6.一种制备蜜蜂抗菌肽AP2的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用包含权利要求2所述蜜蜂抗菌肽基因Kap的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗长财，胡祥，
申请(专利权)人：江西科诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：