一种由基因工程菌制备的芹菜素及其在涤纶纤维制造中应用制造技术

一种由基因工程菌制备的芹菜素及其在涤纶纤维制造中应用。本发明专利技术提供一种优化的黄酮合酶及其编码基因，该黄酮合酶是根据大肠杆菌表达系统进行改造优化，并由此获得重组的大肠杆菌工程菌，与未经基因改造所获得的重组大肠杆菌相比，其生产芹菜素的产量和转化率均有明显提高，极大的降低了涤纶纤维制造的生产成本，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种由基因工程菌制备的芹菜素及其在涤纶纤维制造中应用


[0001]本专利技术属于代谢工程和合成生物学
，涉及生产芹菜素的基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]芹菜素(英文名称：apigenin，AP)，是一种天然的植物黄酮类化合物，其化学结构为4
′
，5，7
‑
三羟基黄酮，亦称芹黄素、洋芹素，分子式C
15
H
10
O6，是一种低分子量黄酮(相对分子质量为270.24)，熔点为347.5℃；不溶于水，适度溶于热乙醇，可溶于稀释的KOH和二甲基亚砜(DMSO)。芹菜素主要存在于蔬菜和水果中，如芹菜、茶、洋葱等。在芹菜根中的含量最高，大约为75mg/kg。目前可采用光谱法、色谱法、质谱分析法等对其加以分离和鉴定。芹菜素结构如下所示：
[0003][0004]目前，获取芹菜素的方法仍主要以植物提取法和化学合成法为主，植物提取方法是采用适当的溶剂或手段，以植物(植物全部或者某一部分)为原料提取或加工而成的物质。以从芹菜中提取芹菜素为例，采摘适量的芹菜叶，低温干燥2 4h后粉碎，按照1∶10的料液比，用70％乙醇回流提取2h后，将提取液旋转蒸发浓缩成浸膏，依次通过大孔树脂(XDA
‑
1)、聚酰胺树脂和葡聚糖凝胶(SephadexLH
‑
20)色谱柱分离纯化该浸膏得到了三种黄酮化合物单体，分别是芹菜素、芹菜苷、柯伊利素
‑7‑0‑
葡萄糖
‑2‑0‑
芹糖苷。黄飞燕等人从旱芹中用70％的乙醇提取芹菜素，发现当料液比例为1：4，提取时间为3h，回流提取二次时，获得的旱芹提取物中芹菜素的含量为1.41％。虽然芹菜素广泛地分布在多数植物中，但是在植物体内的含量却不是很高，传统的提取法操作比较简单，但所需要的时间较长，需要大量的植物材料，受植物生长的季节和地域等因素限制，提取时间长，成本高，提取率和纯度也有待提高，同时需要消耗大量的有机试剂，对人体和环境都有严重的损害。近年来，人们一直在改进和优化提取的手段，比如利用超声波和葡萄糖苷酶相结合的方法裂解芹菜，以提高芹菜素的提取效率，然而，产率依旧不高，并需要一些专门的仪器设备。植物提取的方法并不适用于芹菜素的大量获取。化学合成法基本上采用的是以天然植物单体为原料的半合成法。比如，肖旻用柚皮苷作为原料，加入1，4
ꢀ‑
二氧六环溶剂，在95℃条件下加入氧化剂二氯二氰基苯醌(DDQ)搅拌反应8h，在室温下静置12h，制得芹菜素糖苷粗品，然后用4％的氢氧化钠溶液溶解芹菜苷粗品，加入乙醇调节pH至5
‑
6(加酸前温度要保持在70℃到 75℃)，静置析出晶体，用甲醇/水混合溶液重新结晶2次得到较为纯净的芹菜苷再加入7倍体积的6％的盐酸水溶液在95℃到100℃下搅拌3.5h，反应完全后停止搅拌，调节pH为5
‑
6，静置4h，待沉淀析出后液体呈现清液状态，抽滤获得芹菜素的粗品，再用4％的氢氧化钠溶液溶解，加
入甲醇，用盐酸调节pH值为6，析出晶体后抽滤。接着用乙醇回流提纯得到较纯的芹菜素。此方法所用的底物柚皮苷也是一种双氢黄酮类化合物。肖金霞等人通过化学法合成芹菜素，主要涉及到两个步骤：以对羟基苯乙酮为底物，进行对羟基苯乙酰乙酸乙酯的制备和通过环合反应制备芹菜素。化学法合成黄酮类化合物所涉及到的步骤繁多，过程复杂，导致产率不高，而且反应条件极端苛刻也是限制因素，合成过程中所用有毒试剂较多，同时较多的副产物也增加了所需化合物的提纯难度。
[0005]虽然现在已有通过基因工程来生产芹菜素的生物合成方法，然而现有的生物合成仍然停留使用天然产物层面，不论是产量还是底物转化率均不能达到满意的效果，导致生产成本高昂。因此，迫切需要开发能过高产率获得芹菜素的生产方法。

技术实现思路

[0006]为了填补现有技术的空白，本专利技术提供优化的黄酮合酶(flavone synthase， FNS
‑
I)及其编码基因，通过构建基因工程菌株，显著的提高了重组大肠杆菌的芹菜素转化率。为了实现上述技术效果，本专利技术提供如下的技术方案：
[0007]本专利技术的第一个方面，提供一种优化的黄酮合酶，所述黄酮合酶的编码基因如SEQ ID NO.2
‑
4任一所示。
[0008]本专利技术的第二个方面，提供一种重组宿主细胞，所述宿主细胞表达上述黄酮合酶的编码基因。
[0009]在一种实施方式中，所述重组宿主细胞为大肠杆菌。
[0010]本专利技术的第三个方面，提供上述黄酮合酶或重组宿主细胞在生产芹菜素及其下游产品中的应用。
[0011]在一种实施方式中，所述下游产品包括含有上述芹菜素的生物纤维材料。
[0012]本专利技术的第四个方面，提供一种高效生产芹菜素的方法，所述方法包括，将上述重组宿主细胞在含有柚皮素的底物中进行转化。
[0013]本专利技术相对于现有技术，获得了如下显著的进步：
[0014]本专利技术将现有的黄酮合酶，针对大肠杆菌表达系统进行改造优化，并由此获得重组的大肠杆菌，与未经基因改造所获得的重组大肠杆菌相比，芹菜素的产量和转化率均有明显提高，极大的降低了生产成本。
附图说明
[0015]下面结合附图来对本专利技术作进一步详细说明：
[0016]图1为芹菜素合成路线。
具体实施方式
[0017]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]实施例1 FNS
‑
I序列优化
[0019]1.实验材料
[0020]pETDuet
‑
1载体：购自优宝生物；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒：购自 OMEGA；限制性内切酶购自NEB。
[0021]标准品化合物芹菜素(CAS号：520
‑
36
‑
5)、柚皮素(CAS号：480
‑
41
‑
1) 购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98％。其他试剂为国产分析纯或色谱纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。
[0022]克隆感受态细胞DH5α、表达感受态细胞Rosetta(DE3)：购自全式金。
[0023]液相检测条件：A相：0.1％甲酸水，B相：乙腈；分离条件：0
‑
20min 20％ B相
‑
55％B相，20
‑
22min 55％B相
‑
100％B相，22
‑
27min 100％B相， 27
‑
35min100％B相
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20％B相，35
‑
40min，20％B相；检测波长：340nm，柱温：3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种优化的黄酮合酶，其特征在于，所述黄酮合酶的编码基因如SEQ ID NO.2
‑
4任一所示。2.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达如权利要求1所述的黄酮合酶的编码基因。3.如权利要求2所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为大肠杆菌。4.一种如权利要求1所述的黄酮合酶或如权利要求2
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：黄效华，朱美芳，伏广伟，蔡强，池姗，刘健，甄丽，郑天勇，
申请(专利权)人：百草边大生物科技青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：