工程菌及其高效催化CDCA生产UDCA的方法技术

本发明专利技术属于生物催化技术领域，本发明专利技术公开了一种工程菌及其高效催化CDCA生产UDCA的方法。本发明专利技术以大肠杆菌BW25113作为出发菌株，通过敲除基因，得到两株能够显著提高内源辅酶NAD(P)H转换效率的底盘菌株ΔmazG BW25113和Δpgi BW25113。在此基础上，将7α

【技术实现步骤摘要】
工程菌及其高效催化CDCA生产UDCA的方法


[0001]本专利技术属于生物催化


技术介绍

[0002]熊去氧胆酸(UDCA)，化学名称为3α,7β
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二羟基
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5β
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胆甾烷
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24
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酸，是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，在临床上主要用于治疗各种胆石疾病，急性、慢性肝病，是美国FDA批准治疗原发性胆汁性肝硬化疾病的唯一药物。近年来，随着对UDCA的深入研究，发现其还具有细胞保护、免疫调节及抗癌作用，因此，UDCA作为保健品应用在日常保健领域。鉴于UDCA在治疗肝胆类等疾病方面疗效强、副作用小的优点，UDCA的市场需求每年呈递增趋势。
[0003]传统获得UDCA的方式是从人工养殖熊胆汁中提取，由最初的“有管引流”发展到“无管引流”，鉴于熊胆中获取UDCA含量有限，且有违于动物保护，因此如何实现UDCA的人工合成具有重要意义。目前UDCA的合成主要有两种方式：1)化学合成，包括常规的化学合成和电化学催化两种方法。如专利CN111072744A以胆酸作为原料，经过保护基团、氧化、还原等步骤合成UDCA。专利CN106868534A则以纯金反应电极，纳米钯作为催化剂，通过电催化的方式制备UDCA。化学合成的特点是涉及步骤较多、立体选择性差、或需要使用重金属作为催化剂。2)生物合成，即以胆酸或鹅去氧胆酸作为原料，通过酶/细胞催化制备UDCA。目前关于生物合成UDCA的报道较多，如专利CN105861613A、CN112725212A等均以鹅去氧胆酸为底物，在添加辅因子的前提下，通过7α
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HSDH和7β
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HSDH催化生成UDCA。生物合成相比于化学合成成本较低，且有步骤少、污染小、易操作等特点，是规模化生产UDCA的发展方向。目前报道的绝大多数生物合成UDCA的方法，需要额外添加辅因子来提高底物的投料量，鉴于辅因子在生产UDCA的重要性以及其居高不下的市场价格，迫切需要开发新的工艺实现高投料，低成本的模式生产UDCA。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术克服现有技术中的不足，以大肠杆菌BW25113为出发菌株，通过敲除关键基因获得提高内源辅因子转换效率的底盘菌株，实现7α
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HSDH
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LDH和7β
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HSDH
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GDH的异源表达，并构建辅因子再生循环体系串联高效生产UDCA。
[0005]本专利技术的目的是提供了一株工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113，所述工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113由含有7α
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HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体转入敲除mazG基因片段的底盘菌株中获得；所述含有7α
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HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体是由7α
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HSDH基因和LDH基因导入pBAD质粒载体获得；所述敲除mazG基因片段的底盘菌株是由大肠杆菌BW25113菌株敲除mazG基因获得；所述敲除mazG基因的技术为Red
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同源重组技术；所述7α
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HSDH基因具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述LDH基因具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；所述mazG基因具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0006]本专利技术另外一个目的还提供了一种全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，包括如下步骤：权利要求1所述工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7
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酮石胆酸；工程菌7β
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HSDH
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GDH
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Δpgi BW25113催化中间体7
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酮石胆酸转变成熊去氧胆酸。
[0007]在本专利技术的具体实施方式中，所述工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7
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酮石胆酸包括如下步骤：PB缓冲溶液中加入全细胞催化剂菌体7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113，加入CDCA和丙酮酸钠，控制反应条件生成中间体7
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酮石胆酸。
[0008]在本专利技术的具体实施方式中，所述工程菌7β
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HSDH
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GDH
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Δpgi BW25113催化中间体7
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酮石胆酸转变成熊去氧胆酸包括如下步骤：在中间体7
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酮石胆酸的反应溶液中加入工程菌7β
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HSDH
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GDH
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Δpgi BW25113，加入葡萄糖，控制反应条件生成熊去氧胆酸。
[0009]在本专利技术的具体实施方式中，所述工程菌7β
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HSDH
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GDH
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Δpgi BW25113由含有7β
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HSDH基因片段和GDH基因片段的质粒载体转入敲除pgi基因片段的底盘菌株中获得；所述含有7β
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HSDH基因片段和GDH基因片段的质粒载体是由7β
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HSDH基因和GDH基因导入pBAD质粒载体获得；所述敲除pgi基因片段的底盘菌株是由大肠杆菌BW25113菌株敲除pgi基因获得；所述敲除pgi基因的技术为Red
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同源重组技术；所述7β
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HSDH基因具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；所述GDH基因具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；所述pgi基因具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
[0010]本专利技术与现有的技术相比，具有以下有益效果：
[0011](1)本专利技术以大肠杆菌BW25113为出发菌株，通过敲除靶基因ΔmazG、Δpgi，增加了细胞中内源辅酶NAD(P)H的产量，并构建辅酶再生体系高效全细胞催化生产UDCA，因此无需额外添加昂贵的辅酶，比现有已报道的生物催化的成本明显减低。
[0012](2)底物浓度高达150g/L，反应时间短，操作简单，底物转化率≥99％，纯度≥98.5％，且无任何副产物生成。
[0013](3)底物投料高、生产成本低、反应温和、转化率高、生产效率高。
附图说明
[0014]图1.催化鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸的原理图。
[0015]图2. 7α
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HSDH
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LDH...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113，其特征在于，所述工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113由含有7α
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HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体转入敲除mazG基因片段的底盘菌株中获得；所述含有7α
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HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体是由7α
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HSDH基因和LDH基因导入pBAD质粒载体获得；所述敲除mazG基因片段的底盘菌株是由大肠杆菌BW25113菌株敲除mazG基因获得；所述7α
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HSDH基因具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述LDH基因具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；所述mazG基因具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。2.全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，包括如下步骤：权利要求1所述工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7
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酮石胆酸；工程菌7β
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HSDH
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GDH
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Δpgi BW25113催化中间体7
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酮石胆酸转变成熊去氧胆酸。3.依据权利要求2所述的全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，所述工程菌7α
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HSDH
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LDH
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ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7
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酮石胆酸包括如下步骤：PB缓冲溶液中加入全细胞催化剂菌体7α
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HSDH
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LDH
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Δma...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱俊歌，吴胜，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：