一个柿RNA结合蛋白DkRBM24-1及其应用制造技术

本发明专利技术提供一个柿RNA结合蛋白DkRBM24

【技术实现步骤摘要】
一个柿RNA结合蛋白DkRBM24
‑
1及其应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个柿RNA结合蛋白DkRBM24
‑
1及其应用。是一个来源于柿果实的RNA结合蛋白编码基因，命名为DkRBM24
‑
1。本专利技术还涉及该基因编码的核苷酸序列、氨基酸序列、以及该基因在制备调控乙烯和脱落酸合成、果实软化产品中的应用。

技术介绍

[0002]柿(Diospyros kaki)是柿科柿属的多年生落叶果树，果实形态多样、营养丰富。中国是柿的原产地和主要栽培区域，年产量约占全世界的70％。
[0003]根据柿果实成熟时是否含有涩味，可以简单地将其分成甜柿和涩柿两大类。甜柿能够在树上完成自然脱涩，成熟时单宁含量很低；涩柿则需要在采后进行脱涩处理方可食用。我国栽培的柿品种以涩柿为主，果实成熟后仍含有较高含量的单宁，采后脱涩技术十分关键。然而，对于大多数涩柿品种来说，采后脱涩过程总是伴随着果实的快速软化，影响其贮运品质。因此，研究涩柿果实采后软化的调控因子，对控制柿果实脱涩保脆具有重要的产业意义。
[0004]乙烯和脱落酸是影响果实成熟软化的两种重要植物激素，其中1
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氨基环丙烷羧酸合成酶(ACS)和9
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顺式
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环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)分别是乙烯和脱落酸合成的关键酶。前人研究发现，在番茄、苹果、草莓等果实中过量表达或沉默ACS和NCED编码基因，可以分别影响乙烯释放和脱落酸积累，证实了它们对乙烯和脱落酸合成的重要影响。同时，乙烯和脱落酸合成受抑制的果实，其成熟进程也会发生变化，通常硬度下降缓慢。
[0005]利用生物技术分离了柿果实RNA结合蛋白编码基因，发现DkRBM24
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1受高浓度CO2脱涩处理诱导，并可促进乙烯和脱落酸合成，参与柿果实采后脱涩软化进程的调控。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一个柿RNA结合蛋白DkRBM24
‑
1，是一个与柿果实脱涩软化以及乙烯和脱落酸合成相关的RNA结合蛋白DkRBM24
‑
1及其编码基因。本专利技术所提供的DkRBM24
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1基因来源于柿(Diospyros kaki cv.Jingmianshi)，是RNA结合蛋白家族中的一员，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示；其中核苷酸序列全长882bp；氨基酸序列是由293个氨基酸残基组成，蛋白质分子量约为31.73kD，等电点8.91。
[0007]本专利技术的另一目的是提供DkRBM24
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1在调控乙烯和脱落酸合成、果实软化中的应用。将DkRBM24
‑
1过量表达于柿果实圆片中，可显著诱导乙烯和脱落酸合成关键基因DkACS1和DkNCED2+3
’
的表达水平。ACS是乙烯合成的关键催化酶之一，可以催化S
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腺苷甲硫氨酸生成1
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氨基环丙烷
‑1‑
羧酸(ACC)，然后ACC再在ACC氧化酶的作用下生成乙烯。NCED则是脱落酸合成的关键催化酶，可以催化紫黄质或新黄质转变为黄氧素，再迅速代谢成为脱落酸。乙烯和脱落酸含量的增加会加速果实的软化，主要表现为果实硬度下降、细胞壁降解相关基因(如DkXTH9、DkEGase1)表达量上升。
[0008]此外，利用外源乙烯或脱落酸处理都能加速果实软化，进一步验证了乙烯和脱落酸与果实软化密切相关。与空气处理的空白对照相比，乙烯处理一天后果实硬度的差距即可达到10N，两天后就大于20N；尽管脱落酸处理效果没有乙烯明显，但最大硬度差异也可达到10N。说明乙烯和脱落酸含量升高后可加速果实的软化进程。
[0009]本专利技术提供了一个RNA结合蛋白编码基因DkRBM24
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1及其蛋白、核苷酸序列，本专利技术研究发现，在高浓度CO2脱涩处理下，DkACS1和DkNCED2+3
’
的表达水平升高，柿果实同时积累乙烯和脱落酸，果实快速软化。本专利技术提供的基因来源于柿果实。将DkRBM24
‑
1瞬时过量表达于柿果实圆片中，可使乙烯和脱落酸合成关键基因DkACS1和DkNCED2+3
’
的表达水平显著升高。预期过量表达该基因可以增加乙烯和脱落酸的含量，进而影响植株的衰老以及果实成熟软化。与DkRBM24
‑
1的核苷酸序列相似度大于90％及以上的基因，即使来源于不同的物种，同样在本专利技术的保护范围内。
附图说明
[0010]图1是不同品种柿果实中DkRBM24
‑
1响应脱涩处理的基因表达模式图。
[0011]图2是瞬时过量表达35S::DkRBM24
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1的柿果实圆片中相关基因的表达情况。
具体实施方式
[0012]本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。
[0013]实施例1.不同品种柿果实中DkRBM24
‑
1基因响应不同脱涩处理的表达模式
[0014]研究方法：
‘
磨盘柿
’
成熟果实于2012年采收于北京房山商业果园，
‘
镜面柿
’
和
‘
刀根早生
’
果实则于2014年采自山东青岛商业果园。实验果挑选标准为果形大小均一，无机械伤病虫害。将
‘
磨盘柿
’
和
‘
镜面柿
’
果实分别平均分成三组，在20℃条件下，将果实密封在20L的桶内，分别用95％CO2、95％CO2+1μL/L 1
‑
MCP和空气(作为对照)处理24小时，然后取出贮藏于20℃。在各个取样点，果实只取果肉部分，去掉果皮、带籽部分和中柱，经液氮冷冻后，存放于
‑
80℃保存。高浓度CO2处理后，磨盘柿
’
和
‘
镜面柿
’
果实脱涩并快速软化；CO2+1
‑
MCP混合处理后，果实脱涩但硬度下降缓慢；对照组果实则仍有涩味且硬度下降缓慢。而
‘
刀根早生
’
果实，在高浓度CO2处理下仅脱涩而不软化，因此未进行CO2+1
‑
MCP混合处理，只做了95％CO2和对照两种处理。
[0015]使用在线软件Primer 3.0(v.0.4.0；http://bioinfo.ut.ee/primer3
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0.4.0/)对DkRBM24
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1设计实时荧光定量PCR引物对(SEQ:NO.3和SEQ:NO.4)，并通过溶解曲线分析和PCR产物测序双重确认，反应体系为10μl Ssofast EvaGreen Supermix(Bio
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个柿RNA结合蛋白DkRBM24
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1，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。2.权利要求1所述的一个柿RNA结合蛋白DkRBM24
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1，其特征在于，其编码基因的氨基酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓芬，吴薇，王文球，殷学仁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：