母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用制造技术

本发明专利技术公开了母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用，母乳细胞外囊泡的制备包括以下步骤：收集人的新鲜母乳，离心去除脂肪，取上清；然后离心去除细胞和碎片，取上清；再用过滤膜过滤，将所得上清液离心收集沉淀，加入溶剂重悬沉淀；再离心去除溶剂，加入少量溶剂重悬沉淀；最后用过滤膜过滤即得到母乳细胞外囊泡。母乳细胞外囊泡可被间充质骨髓干细胞摄取，提高间充质骨髓干细胞Runx2，Alp和Bmp2蛋白的转录水平，促进间充质骨髓干细胞向成骨细胞分化。将母乳细胞外囊泡装载至骨组织工程支架材料上，可显著促进骨再生。可显著促进骨再生。可显著促进骨再生。

【技术实现步骤摘要】
母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用


[0001]本专利技术属于生物医用材料领域，具体涉及母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用。

技术介绍

[0002]骨移植是骨科手术中最常用的促进骨再生的手术方法之一。在所有临床可用的骨移植中，自体骨仍被认为是金标准，因为骨再生所需的所有必要特性，骨传导、骨诱导和骨生成都被结合起来。然而，供应有限和供体并发症的担忧仍然存在。因为同种异体骨移植形式多样，数量众多，同种异体骨移植在骨科移植中占主导地位。然而，与使用自体移植物相比，同种异体骨移植会导致较差的愈合，也有疾病传播和其他感染因子传播的可能。更重要的是，传统上可用的天然骨移植数量仍然远远不能满足临床需求。
[0003]为了解决这些局限性，合成骨替代品成为骨科行业最具潜力的市场之一。其中，以磷酸钙(CaP)为基础的生物材料(如羟基磷灰石(Hap)、CaP水泥和陶瓷)和重组人骨形态蛋白(rhbmp，如rhBMP
‑
2和rhBMP
‑
7)应用最为广泛，无论是单独使用还是联合使用。原来的骨替代品一般仅具有骨导电性，主要应用于大骨缺损的重建，而重组人骨形态蛋白基本具有骨诱导作用，具有促进骨折愈合的能力。然而，重组人骨形态蛋白在临床应用中因其超生理剂量、不良临床结果和成本问题而受到了广泛关注。因此，迫切需要研究开发更多的药物或生物材料，为促进骨再生提供更多有效的途径。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用。
>[0005]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0006]一种母乳细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0007]收集人的新鲜母乳，离心力500～5000
×
g(优选2000
×
g)，离心5～30min去除脂肪，取上清；然后10000～16000
×
g(优选12000
×
g)，离心15～45min(优选30min)去除细胞和碎片，取上清；再用过滤膜过滤，将所得上清液100000～160000
×
g(优选12000
×
g)离心2～24h(优选2h)，收集沉淀，加入溶剂重悬沉淀；再以100000～160000
×
g(优选12000
×
g)超离2～24h(优选2h)，去除溶剂，加入少量溶剂重悬沉淀；最后用过滤膜过滤即得到母乳细胞外囊泡；
[0008]上述操作均在4℃的环境中进行；
[0009]所述溶剂是与母乳细胞外囊泡具有生物相容性的溶剂，为缓冲液或液体培养基；
[0010]所述的缓冲液优选PBS缓冲液，pH值为6.5～7.5，pH值优选7；
[0011]所述液体培养基选自DMEM液体培养基、MEM液体培养基、RPMI 1640液体培养基、F12液体培养基或IMDM液体培养基中的一种或几种；
[0012]所述过滤膜(针头除菌过滤器的滤头)为0.1～1μm的微孔除菌过滤膜，优选0.22μm的微孔除菌过滤膜。
[0013]由上述方法制得的母乳细胞外囊泡，尺寸为30～1000nm，蛋白浓度为0.01～1000μg/mL，颗粒数为1
×
108～1
×
10
13
/mL；
[0014]当尺寸过小(小于30nm)时，现有的离心条件满足不了；当尺寸过大(大于1000nm)时，所提取的可能为细胞碎片，而不是细胞外囊泡；
[0015]优选地，蛋白浓度为0.1～100μg/mL；更优选地，蛋白浓度为1～50μg/mL；更进一步优选地，蛋白浓度为25μg/mL；
[0016]优选地，颗粒数为1
×
108～1
×
10
13
/mL；更优选地，颗粒数为1
×
109～1
×
10
12
/mL；更进一步优选地，颗粒数为3
×
10
11
/mL。
[0017]母乳细胞外囊泡在制备骨修复材料中的应用；母乳细胞外囊泡可被间充质骨髓干细胞摄取，分别在第6h和12h激化Akt磷酸化和ERK(1/2)磷酸化；母乳细胞外囊泡可通过基因调控，第3、5、7和12天连续提高间充质骨髓干细胞Runx2，Alp和Bmp2蛋白的转录水平，促进间充质骨髓干细胞向成骨细胞分化。
[0018]一种骨修复材料，是在骨组织工程支架材料中吸附母乳细胞外囊泡，其中骨组织工程支架材料与母乳细胞外囊泡的体积比为1:0.5～2。
[0019]所述的骨组织工程支架材料是冻干的水凝胶、医用海绵或医用泡沫；
[0020]所述水凝胶可为通过物理作用形成的水凝胶，例如聚丙烯酰胺与聚丙烯酸共混形成的凝胶等；水溶性高分子与金属离子相互作用形成的凝胶，例如海藻酸钠、壳聚糖分别与钙离子、磷酸根形成海藻酸钠、壳聚糖水凝胶等；聚阳离子电解质与聚阴离子电解质相互作用形成的水凝胶，例如海藻酸与壳聚糖相互作用形成海藻酸
‑
壳聚糖水凝胶等；高分子链聚合形成水凝胶，例如明胶与琼脂等；
[0021]优选地，所述的水凝胶为双键修饰的透明质酸；
[0022]所述双键修饰的透明质酸，由以下步骤制得：
[0023]将透明质酸与甲基丙烯酸酐或丙烯酰氯反应，得到可光交联的经双键修饰的透明质酸；将经双键修饰的透明质酸溶解后，加入光引发剂，除去气泡后，置于模具中，在紫外光照射下引发聚合反应，即得到双键修饰的透明质酸。
[0024]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0025]本专利技术的母乳细胞外囊泡携带丰富的生物活性物质，如非编码RNA、mRNA、DNA、蛋白质等分子，通过传递含有特定的货物来有效地介导细胞间和器官间的通讯。研究发现，母乳细胞外囊泡可被间充质骨髓干细胞摄取，分别在第6h和12h激化Akt磷酸化和ERK(1/2)磷酸化，通过基因调控，可第3、5、7和12天连续提高间充质骨髓干细胞Runx2，Alp和Bmp2蛋白的转录水平，促进间充质骨髓干细胞向成骨细胞分化。将母乳细胞外囊泡装载至骨组织工程支架材料上，用于大鼠颅骨缺损模型，发现基于母乳细胞外囊泡的骨组织工程支架可显著促进骨再生。
[0026]另外，所述基于母乳细胞外囊泡骨组织工程支架的材料来源于食物母乳，且制备工艺简便，绿色安全，易于实现；因此，本专利技术提供的骨组织工程支架在作为或制备促进骨缺损再生形成的产品或制品中具有广阔的推广应用前景。
附图说明
[0027]图1是母乳细胞外囊泡的透射电镜图。
[0028]图2是母乳细胞外囊泡的纳米流式结果图。
[0029]图3是Western blotting检测所提取母乳细胞外囊泡是否含有CD9和CD63蛋白的结果图。
[0030]图4是不同浓度母乳细胞外囊泡及去细胞外囊泡母乳对Akt磷酸化的激活结果。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种母乳细胞外囊泡的制备方法，其特征在于包括以下步骤：收集人的新鲜母乳，离心力500～5000
×
g，离心5～30min去除脂肪，取上清；然后10000～16000
×
g，离心15～45min去除细胞和碎片，取上清；再用过滤膜过滤，将所得上清液100000～160000
×
g离心2～24h，收集沉淀，加入溶剂重悬沉淀；再以100000～160000
×
g超离2～24h，去除溶剂，加入少量溶剂重悬沉淀；最后用过滤膜过滤即得到母乳细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述溶剂为缓冲液或液体培养基。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为PBS缓冲液，pH值为6.5～7.5；所述液体培养基为DMEM液体培养基、MEM液体培养基、RPMI 1640液体培养基、F12液体培养基或IMDM液体培养基中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴钧，冼彩虹，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：