Α-肌聚糖的腺相关病毒载体递送和肌营养不良症的治疗制造技术

本文描述了治疗受试者的肌营养不良症的方法，其包括使用全身性施用途径并以约1.0

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】Α
‑
肌聚糖的腺相关病毒载体递送和肌营养不良症的治疗
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2019年8月21日提交的美国临时申请第62/889,749号、2020年4月24日提交的美国临时申请第63/014,934号和2020年5月11日提交的美国临时申请第63/022,843 号的优先权，所有都通过引用整体并入本文。


[0003]本文描述了治疗载体，例如表达α
‑
肌聚糖的AAV载体，以及使用这些载体治疗肢带型肌营养不良症，例如LGMD2D的方法。
[0004]通过引用并入序列表
[0005]本申请含有作为公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名： 54652_SeqListing.txt；18,768字节
‑
ASCII文本文件；2020年8月17日创建)，所述申请通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0006]肌营养不良症(MD)是一组遗传疾病。所述组的特征在于控制运动的骨骼肌的进行性无力和退化。某些形式的MD在婴儿期或儿童期发展，而其它形式的MD直到中年或以后才可出现。病症在肌肉无力的分布和程度(某些形式的MD也影响心肌)、发病年龄、进展速度和遗传模式方面不同。
[0007]一组MD是肢带型肌营养不良症(LGMD)。LGMD是一种罕见的病状，并且不同的人在发病年龄、肌肉无力区域、心脏和呼吸系统受累、进展速度和严重程度方面表现不同。LGMD 可能始于儿童期、青春期、青年期或甚至更晚。两性都受到同等的影响。LGMD导致肩部和骨盆带无力，大腿和手臂附近的肌肉有时也会随着时间的推移而减弱。腿部无力通常先于手臂出现。面部肌肉通常不受影响。随着病状的进展，人们可能会出现行走问题，并且随着时间的推移可能需要使用轮椅。肩部和手臂肌肉的受累可能导致难以将手臂举过头顶和举起物体。在某些类型的LGMD中，心脏和呼吸肌可能受累。
[0008]针对LGMD的专门测试现在可以通过国家诊断计划，国家诊断计划国家委员会(NationalCommissioning Group；NCG)获得。
[0009]2D亚型LGMD(LGMD2D)(通常被称为α
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肌聚糖病)是一种常染色体隐性遗传病，由α
‑
肌聚糖基因(SGCA；α
‑
肌聚糖)突变引起，从而导致功能性蛋白质的完全或减少的缺失以及肌营养不良蛋白相关蛋白复合物的其他结构组分的缺失。值得注意的是，α
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肌聚糖蛋白的缺失导致进行性肌营养不良症，伴以肌肉功能恶化，发病年龄为3至8岁。症状包括：行走延迟、由脂肪替代和纤维化引起的近端肌肉无力、肌酸激酶升高、脊柱侧弯和关节挛缩。这种使人衰弱的疾病常常导致依赖轮椅并因呼吸衰竭而死亡。因此，仍然存在对用于 LGMD2D的治疗的需求。

技术实现思路

[0010]本文描述治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒 (rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径并基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约1.0
×
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至约5.0
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的剂量施用。在一个方面中，本公开涉及表达α
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肌聚糖基因的rAAV，和将α
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肌聚糖递送至肌肉以减少和/或预防纤维化；和/或增加肌肉力量，和/或治疗患有肌营养不良症的受试者的α
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肌聚糖病的方法。
[0011]在一个方面中，本文描述重组AAV(rAAV)，其包含编码α
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肌聚糖蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1中示出的核苷酸序列至少65％、 70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列并编码保留α
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肌聚糖活性的蛋白质。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1中示出的核苷酸序列。在另一实施方案中，多核苷酸编码与SEQ ID NO:2中示出的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或99.5％相同的蛋白质。在另一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQID NO:2中示出的氨基酸序列的蛋白质。
[0012]在一些实施方案中，rAAV包含含有tMCK启动子的核苷酸序列。例如，tMCK启动子包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列。此外，rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列和/或SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。在一些实施方案中，rAAV包含SEQ ID NO: 7的poly A序列。在一个实施方案中，所公开的rAAV是血清型AAVrh.74。
[0013]在一个实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:4至少65％、70％、75％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或99.5％相同的核苷酸序列。在一个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 4中示出的核苷酸序列。
[0014]本公开提供治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用本文公开的rAAV 中的任一种的步骤，其中rAAV通过全身途径施用。特别地，在所公开方法中的任一种中， rAAV是AAVrh74.tMCK.hSCGA，其中rAAV使用全身性施用途径施用。
[0015]在所公开方法中的任一种中，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，rAAV以约 1.0
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vg/kg至约5.0
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vg/kg的剂量施用。例如，基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，rAAV以约1.0
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vg/kg至约2.0
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vg/kg、约5
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vg/kg至约5.0
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vg/kg至约2
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14本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径并基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约1.0
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至约5.0
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的剂量施用。2.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约1.0
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vg/kg至约2.0
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vg/kg或约5
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vg/kg至约2
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vg/kg的剂量施用。3.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5
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vg/kg至约2
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vg/kg的剂量施用。4.如权利要求1所述的方法，其中所述rAAV基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5
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vg/kg、约1
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vg/kg或约2
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vg/kg的剂量施用。5.一种治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括施用重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA的步骤，其中所述rAAV使用全身性施用途径施用并基于作为定量标准的线性化DNA或质粒以约1.85
×
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13
vg/kg或7.41
×
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vg/kg的剂量施用。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前的α
‑
肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α
‑
肌聚糖基因表达水平在施用所述rAAV之后增加；其中与施用所述rAAV之前的血清CK水平相比，所述受试者的血清CK水平在施用所述rAAV之后降低；其中自主活动和比力产生增加；其中纤维化减少；其中胫骨前肌中对收缩诱导损伤的抵抗力增加；和/或其中与施用所述rAAV之前的α
‑
肌聚糖阳性纤维的数量相比，所述受试者的肌肉组织中的α
‑
肌聚糖阳性纤维的数量在施用所述rAAV之后增加。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述全身性施用途径是静脉内途径。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过注射、输注或植入来施用。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过输注来施用。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。12.如权利要求11所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的编码多肽序列的核苷酸序列。14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:2中所示的编码多肽序列的核苷酸序列。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。16.如权利要求15所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含tMCK启动子。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述tMCK启动子包含SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列。20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:7的polyA序列。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74。23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良症是2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肢带型肌营养不良症，并且所述rAAV通过静脉输注基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5
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vg/kg至约2
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vg/kg的剂量施用，并且其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前的α
‑
肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α
‑
肌聚糖基因表达水平在施用所述rAAV之后增加。27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前相比，纤维化在所述受试者中在施用所述rAAV之后减少。28.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前相比，所述受试者中的纤维化、中央成核、CK水平和/或胶原沉积在施用所述rAAV之后减少。29.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前相比，所述受试者的肌肉中的比力、纤维直径尺寸和/或离心收缩在施用所述rAAV之后增加。30.如权利要求26所述的方法，其中通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量α
‑
肌聚糖蛋白水平来检测所述α
‑
肌聚糖基因表达。31.一种表达细胞中的α
‑
肌聚糖基因的方法，其包括向受试者施用包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体。32.如权利要求31所述的方法，其中通过在肌肉活检中以蛋白质印迹测量α
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肌聚糖蛋白水平来检测所述受试者的细胞中的所述α
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肌聚糖基因的表达。33.如权利要求31所述的方法，其中通过在肌肉活检中通过免疫组织化学测量所述α
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肌聚糖蛋白水平来检测所述细胞中的所述α
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肌聚糖基因的表达。34.如权利要求31所述的方法，其中在所述受试者中通过检测每微克基因组DNA的载体基因组数量来测量所述α
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肌聚糖基因的表达。35.一种降低有需要的受试者的血清CK水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。36.一种增加受试者的肌肉组织中的α
‑
肌聚糖阳性纤维的方法，其包括向所述受试者施用SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。
37.一种增加有需要的受试者中的α
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肌聚糖的表达的方法，其包括向所述受试者施用有效量的SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。38.一种用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包含基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒剂量为约1.0
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vg/kg至约5.0
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vg/kg的重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA，并且其中所述组合物被配制用于全身性施用途径。39.用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包含基于作为定量标准的线性化DNA或质粒剂量约为1.85
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vg/kg或7.41
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vg/kg的重组腺相关病毒(rAAV)AAVrh74.tMCK.hSCGA，并且其中所述组合物被配制用于全身性施用途径。40.一种组合物，其包含重组腺相关病毒(rAAV)，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。41.如权利要求38或40所述的组合物，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5
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vg/kg至约2
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vg/kg。42.如权利要求38或40所述的组合物，其中基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒，所述rAAV的剂量为约5
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vg/kg、约1
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vg/kg或约2
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vg/kg。43.如权利要求38至42中任一项所述的组合物，其中与施用所述组合物之前的α
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肌聚糖基因表达水平相比，所述受试者的细胞中的α
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肌聚糖基因表达水平在施用所述组合物之后增加；或其中与施用所述组合物之前的血清CK水平相比，所述受试者的血清CK水平在施用所述组合物之后降低；或其中与施用所述组合物之前的α
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肌聚糖阳性纤维的数量相比，所述受试者的肌肉组织中的α
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肌聚糖阳性纤维的数量在施用所述组合物之后增加。44.如权利要求38至43中任一项所述的组合物，其中所述全身性施用途径是静脉内途径。45.如权利要求38至44中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过注射、输注或植入来施用。46.如权利要求38至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过输注来施用。47.如权利要求38至46中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过经外周肢体静脉的静脉内途径来施用。48.如权利要求38至47中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。49.如权利要求48所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。50.如权利要求38至49中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的编码多肽序列的核苷酸序列。51.如权利要求38至49中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:2中所示的编码多肽序列的核苷酸序列。52.如权利要求38至49中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的
scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。53.如权利要求52所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:4的scAAVrh74.tMCK.hSGCA构建体核苷酸序列。54.如权利要求38至53中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含tMCK启动子。55.如权利要求54所述的组合物，其中所述tMCK启动子包含SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。56.如权利要求38至55中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:5的5'反向末端重复序列。57.如权利要求38至56中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:6的3'反向末端重复序列。58.如权利要求38至57中任一项所述的组合物，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:7的polyA序列。59.如权利要求38至58中任一项所述的组合物，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74。60.如权利要求38至59中任一项所述的组合物，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症。61.如权利要求38至60中任一项所述的组合物，其中所述肌营养不良症是2D型肢带型肌营养不良症(LGMD2D)。62.如权利要求38至61中任一项所述的组合物，其中所述受试者患有肢带型肌营养不良症，并且所述组合物被配制用于通过静脉输注基于作为定量标准的超螺旋DNA或质粒以约5
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vg/kg至约2
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【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：全国儿童医院研究所，
类型：发明
国别省市：