L-山梨糖脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了L

【技术实现步骤摘要】
L
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山梨糖脱氢酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及L
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山梨糖脱氢酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程


技术介绍

[0002]维生素C，又称抗坏血酸，是人体必须的一种维生素。广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品和饲料领域。2
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酮基
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L
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古龙酸(2
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KLG)是生产维生素C的直接前体物质，一步发酵生产2
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KLG是一个长期的目标。目前一步发酵生产2
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KLG主要以代谢工程改造为主。而通过酶工程改造提升2
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KLG合成途径中关键酶活性，进而提升2
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KLG产量的研究较少。以D
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山梨醇为底物进行2
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KLG生产是目前较为主流的一步发酵方法。在这个途径中，D
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山梨醇首先通过D
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山梨醇脱氢酶生成L
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山梨糖，随后L
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山梨糖脱氢酶(SDH)催化L
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山梨糖生成L
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山梨酮，最后L
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山梨酮脱氢酶催化L
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山梨酮生成2
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KLG。研究表明，D
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山梨醇到L
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山梨糖的转化率高达98％，而在实际发酵过程中重组菌株只能转化少部分L
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山梨糖。所以，SDH的催化能力被认为是关键限速步骤。但是目前针对SDH改造的研究较少，对SDH进行有效的改造，有可能提升2
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KLG的生产强度。

技术实现思路

[0003]氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH
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004来源的L
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山梨糖脱氢酶(SDH)进行了突变，制备出了可以提升2
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KLG产量的SDH突变体。
[0004]本专利技术提供了L
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山梨糖脱氢酶突变体，以来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH
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004的L
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山梨糖脱氢酶为出发序列，将第368位缬氨酸突变为丙氨酸，和/或将第336位缬氨酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
[0005]在一种实施方式中，所述出发序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V368A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成异亮氨酸(Ile)，突变体命名为V336I。
[0008]在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为V336L。
[0009]在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成甲硫氨酸(Met)，突变体命名为V336M。
[0010]在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成异亮氨酸(Ile)，并将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V336I
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V368A，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成亮氨酸(Leu)，并将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V336L
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V368A，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成甲硫氨酸(Met)，并将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V336M
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V368A，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]本专利技术还提供了编码所述L
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山梨糖脱氢酶突变体的基因。
[0014]在一种实施方式中，编码突变体V368A的核苷酸序列是在SEQ ID NO.6的基础上将第368位密码子由GUG替换为GCU，获得基因序列SEQ ID NO.7。
[0015]在一种实施方式中，编码突变体V336I
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V368A的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基础上将第336位密码子由GUG替换为AUC。
[0016]在一种实施方式中，编码突变体V336L
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V368A的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基础上将第336位密码子由GUG替换为CUU。
[0017]在一种实施方式中，编码突变体V336M
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V368A的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基础上将第336位密码子由GUG替换为AUG。
[0018]本专利技术还提供携带所述基因的重组质粒。
[0019]在一种实施方式中，所述重组质粒以pMD19
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T为出发质粒。
[0020]本专利技术还提供表达所述L
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山梨糖脱氢酶突变体或携带所述基因的微生物细胞。
[0021]在一种实施方式中，所述微生物细胞的宿主细胞为细菌或真菌细胞。
[0022]在一种实施方式中，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
[0023]在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为宿主，以pMD19
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T为表达载体，表达所述L
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山梨糖脱氢酶及2
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KLG合成途径中关键酶基因。
[0024]在一种实施方式中，以cspA启动子调控包含有L
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山梨糖脱氢酶基因的基因簇(sndh
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sdh)的表达。
[0025]在一种实施方式中，所述表达载体为pMD19
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cspA，已公开于论文《High Throughput Screening Platform for a FAD
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Dependent L
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Sorbose Dehydrogenase》中。
[0026]在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
[0027]本专利技术还提供了所述L
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山梨糖脱氢酶突变体在生产2
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酮基
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L
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古龙酸中的应用。
[0028]在一种实施方式中，所述应用是将表达所述L
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山梨糖脱氢酶突变体的重组大肠杆菌在LB培养基中，于30～37℃，150～250rpm培养至OD
600
＝3制备种子液，转接至山梨糖培养基中于30～37℃发酵。
[0029]本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.L
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山梨糖脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第368位缬氨酸突变为丙氨酸，和/或将第336位缬氨酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。4.一种微生物细胞，其特征在于，表达权利要求1所述的L
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山梨糖脱氢酶突变体，或携带权利要求2所述基因。5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，以为细菌或真菌细胞为宿主细胞。6.一种提高L
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山梨糖脱氢酶活力的方法，其特征在于，将酶的第368位缬氨酸突变为丙氨酸，和/或将第336位缬氨酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。7.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以pMD19
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T为表达载体，表达权利要求1所述的突变体。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，李冬，陈坚，李江华，曾伟主，余世琴，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：