一种甘薯原生质体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种甘薯原生质体的制备方法，属于植物细胞生物学技术领域。包括：将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；将得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；所述酶解液组分：纤维素酶RS、离析酶R10、半纤维素酶、牛血清白蛋白、吗啉乙磺酸等。采用本发明专利技术提供的方法能够获得产量高和活力强的甘薯原生质体。高和活力强的甘薯原生质体。高和活力强的甘薯原生质体。

【技术实现步骤摘要】
一种甘薯原生质体的制备方法


[0001]本专利技术属于植物细胞生物学
，尤其涉及一种甘薯原生质体的制备方法。

技术介绍

[0002]甘薯(Ipomoea batatas[L.]Lam.)，一年生草本植物，旋花科，番薯属，是一种高产而适应性强的粮食作物。块根除作主粮外，也是食品加工、淀粉和酒精制造工业的重要原料，根、茎、叶又是优良的饲料。甘薯起源于热带美洲，是世界上重要的粮食、饲料、能源以及工业原料作物，我国是世界上最大的甘薯生产和消费国。
[0003]植物原生质体是指仅由原生质膜包裹的活细胞，由于没有细胞壁，常被用来作为细胞融合、体细胞杂交、遗传转化和亚细胞定位等研究的理想材料，在许多生理生化研究和植物细胞全能性的理论研究中有重要的应用价值。甘薯具有自交和同群杂交不亲和性，而细胞融合可以克服远源细胞间不亲和的问题，实现杂交及基因重组。目前为止，仍然缺乏一套完整的甘薯原生质体制备方法。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种甘薯原生质体的制备方法，采用本专利技术提供的方法能够获得产量高和活力强的甘薯原生质体。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种甘薯原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0007]1)将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；
[0008]2)将所述步骤1)得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；
[0009]所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶RS、质量百分含量为1.5％的离析酶R10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mM的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6M的甘露醇、摩尔浓度为100mM的氯化钾、摩尔浓度为20mM的氯化钙、摩尔浓度为20mM的氯化镁，pH值为5.5。
[0010]优选的，所述步骤2)酶解液中还包括质量百分含量为1％的蜗牛酶。
[0011]优选的，所述步骤1)甘薯材料包括甘薯的根尖、叶片、叶柄、茎尖分生组织和愈伤组织中一种或多种。
[0012]优选的，所述甘薯材料的长度和宽度分别为0.5～1mm。
[0013]优选的，所述步骤1)甘露醇溶液的摩尔浓度为0.6M，所述暗培养的时间为30min。
[0014]优选的，所述步骤2)暗培养材料的质量与酶解液的体积比为1g:10ml。
[0015]优选的，所述步骤2)酶解的条件包括：温度为28℃，振荡速度为80rpm，酶解时间为2～4h。
[0016]优选的，当甘薯材料为叶片时，所述酶解时间为3h；
[0017]当所述甘薯材料为叶柄时，所述酶解时间为2h；
[0018]当所述甘薯材料为茎尖分生组织时，所述酶解时间为4h；
[0019]当所述甘薯材料为愈伤组织时，所述酶解时间为2h；
[0020]当所述甘薯材料为根尖时，所述酶解时间为3.5h。
[0021]优选的，所述步骤2)酶解后，得到酶解物后还包括：将所述酶解物过滤，将得到的滤液离心，得到的沉淀进行洗涤，得到原生质体。
[0022]优选的，所述离心的条件包括：离心力为250g，离心时间为10min；
[0023]所述洗涤使用的洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.4M的甘露醇溶液。
[0024]本专利技术通过不断调整酶解液组成及浓度，选取最适宜的酶解液配方，在提高原生质体产量的同时，尽可能的避免酶含量过高而导致的原生质体活性降低。优化酶解时长可以避免由于原生质体在酶解液中酶解时间过长而导致的原生质体破碎想象，进而得到高产量和活力强的原生质体。此外，通过选取生理状态好的甘薯实验材料得到活性更高的原生质体。
[0025]本专利技术的有益效果为：
[0026]1)本专利技术通过对甘薯材料生理状态、酶解液组成和酶解时间等方面的研究，提供了一套较为完整的甘薯原生质体制备技术。
[0027]2)本专利技术大大缩短了甘薯原生质体制备所需要的时间，并有利于保证原生质体活力；
[0028]3)利用本专利技术技术获取的甘薯原生质体产量高、活力强，可在原生质体培养、细胞融合和遗传转化等方面中进行应用，具有显著的经济和社会效益。
附图说明
[0029]图1为甘薯根尖原生质体。
具体实施方式
[0030]本专利技术提供了一种甘薯原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0031]1)将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；
[0032]2)将所述步骤1)得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；
[0033]所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶RS、质量百分含量为1.5％的离析酶R10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mM的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6M的甘露醇、摩尔浓度为100mM的氯化钾、摩尔浓度为20mM的氯化钙、摩尔浓度为20mM的氯化镁，pH值为5.5。
[0034]本专利技术将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料。
[0035]在本专利技术中，所述甘薯材料优选为新鲜的甘薯材料。在本专利技术中，所述甘薯材料优选包括甘薯的根尖、叶片、叶柄、茎尖分生组织和愈伤组织中一种或多种。本专利技术对所述茎尖分生组织和愈伤组织的获取方式没有特殊限定，采用常规培养方法得到即可。在本专利技术中，所述甘薯材料的宽度和长度优选分别为0.5～1mm。在本专利技术中，所述甘薯的根尖优选为水培5d的根尖。
[0036]在本专利技术中，所述甘露醇溶液的摩尔浓度优选为0.6M，所述暗培养的时间优选为
30min。在本专利技术中，所述甘露醇溶液的作用是使材料发生质壁分离，利于酶解，所述暗培养的作用是降低由于原生质体光敏性导致的活性低问题。在本专利技术中，所述甘露醇溶液的pH值优选为5.5.。
[0037]本专利技术将得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体。
[0038]在本专利技术中，所述暗培养材料的质量与酶解液的体积比优选为1g:10ml。在本专利技术中，所述酶解的条件优选包括：温度为28℃，振荡速度为80rpm，酶解时间为2～4h。在本专利技术中，当甘薯材料为叶片时，所述酶解时间优选为3h；当所述甘薯材料为叶柄时，所述酶解时间优选为2h；当所述甘薯材料为茎尖分生组织时，所述酶解时间优选为4h；当所述甘薯材料为愈伤组织时，所述酶解时间优选为2h；当所述甘薯材料为根尖时，所述酶解时间优选为3.5h。
[0039]在本专利技术中，所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶RS、质量百分含量为1.5％的离析酶R10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mM的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6M的甘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甘薯原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；2)将所述步骤1)得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶RS、质量百分含量为1.5％的离析酶R10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mM的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6M的甘露醇、摩尔浓度为100mM的氯化钾、摩尔浓度为20mM的氯化钙、摩尔浓度为20mM的氯化镁，pH值为5.5。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)酶解液中还包括质量百分含量为1％的蜗牛酶。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)甘薯材料包括甘薯的根尖、叶片、叶柄、茎尖分生组织和愈伤组织中一种或多种。4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述甘薯材料的长度和宽度分别为0.5～1mm。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄立飞，梁雪莲，赵楠，谢淑燕，邹宏达，陈景益，
申请(专利权)人：仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：