一种基于巯基-烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种基于巯基

【技术实现步骤摘要】
一种基于巯基
‑
烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体公开了一种基于巯基
‑
烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法。

技术介绍

[0002]生物大分子的化学修饰是指通过化学反应的手段将特定功能的基团安装到目标生物大分子上。多肽或蛋白质是化学修饰的主要目标，因为化学修饰可以改善多肽和蛋白质的功能，还可以赋予其新功能，多肽或蛋白质的化学修饰在生命科学、医药、生物材料中发挥了重要的作用。
[0003]半胱氨酸(Cys)重要且独特，其含有的巯基也是很多酶的催化位点。与其它亲核基团相比，巯基展现出鲜明的反应性，并且分布于97％的人源蛋白质中，这意味着基于半胱氨酸的化学修饰比较容易达成位点选择性，同时也具有普适性。特异性蛋白质半胱氨酸修饰通常基于以下三个反应(反应式如下)：
[0004][0005](I)二硫化合物的交换反应，目标Cys与二硫试剂进行硫醇交换，实现功能基转移，该方法特异性好，条件温和，但新生的二硫键会继续发生硫醇交换，失去功能分子；(II)亲核取代反应，载有亲电位点的功能分子烷基化Cys，但是此类反应易受其它亲核残基的干扰；(III)迈克尔加成反应，负载了功能小分子的迈克尔受体与巯基加成，但是此类偶联产物易因逆迈克尔反应丢失功能分子。
[0006]最近也有其它的方法出现在文献和专利中，包括1)半胱氨酸巯基侧链对多氟芳烃、磺酰基氮杂芳烃等芳香亲电试剂的芳香亲核取代反应(S
N
Ar)；2)全氟烷基、烯基和炔基高碘试剂对半胱氨酸残基的烷基化、烯基化和炔基化；3)过度金属有机试剂对半胱氨酸残基的芳基化、硼基化等。然而这些方法由于各自的局限性，目前还未得到普遍应用，尤其难以在医药工业界中实施。
[0007]另外，巯基对普通烯/炔烃的加成反应，即Thiol
‑
ene/Thiol
‑
yne反应(反应式如下)也被用于蛋白质的修饰，但这类反应需要紫外光、光敏剂或自由基引发剂，这些额外的
试剂或条件以及反应本身的效率上的缺陷严重削弱了这些方法的应用前景。
[0008]
技术实现思路

[0009]针对
技术介绍
指出的不足，本专利技术公开了一种基于新机理的修饰方法，能够有效解决现有技术存在的不足。本专利技术提供了一种基于巯基
‑
烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法，其中巯基
‑
烯基叠氮反应的化学原理为：含有巯基的化合物中的巯基自由基对含有烯基叠氮基团的化合物的β位点进行自由基Thiol
‑
ene加成，生成的中间体裂解释放出氮气分子，紧跟着水解，释放氨分子，产物为含有β
‑
羰基硫醚的化合物，通过这个方法化学选择性地在巯基上连接酮羰基。
[0010]其具体方法为：含有巯基的化合物与含有烯基叠氮基团的化合物在反应介质中反应，使含有巯基的化合物修饰为含有β
‑
羰基硫醚的化合物。
[0011]具体反应式如下所示：
[0012][0013]其中，含有巯基的化合物为半胱氨酸及其衍生物，带有自由烷基巯基，来自于液相或固相合成；其结构式(I)为其中P1选自氢，烷基，芳基，杂芳基，
‑
(C＝O)
‑
烷基，
‑
(C＝O)
‑
芳基，
‑
(C＝O)
‑
杂芳基，
‑
(C＝O)
‑
O
‑
烷基，
‑
(C＝O)
‑
O
‑
芳基，
‑
(C＝O)
‑
O
‑
杂芳基，
‑
(C＝O)
‑
NH
‑
烷基，
‑
(C＝O)
‑
NH
‑
芳基，
‑
(C＝O)
‑
NH
‑
杂芳基，二肽基，或多肽基，上述二肽和多肽是指由2个以上任意天然氨基酸、常见非天然氨基酸或它们的任意组合通过酰胺键连接而构成分子片段。
[0014]P2选自羟基，
‑
O
‑
烷基，
‑
NH
‑
烷基，
‑
NH
‑
芳基，
‑
NH
‑
杂芳基，
‑
NH
‑
二肽基，或
‑
NH
‑
多肽基以及环胺基，如：脯氨酸衍生物。
[0015]含有巯基的化合物也可以是天然多肽或天然蛋白、基因工程多肽蛋白以及其它修饰蛋白，下表1列出了本专利涉及的部分氨基酸、肽和蛋白，但不限于此表所收集的氨基酸、肽和蛋白。
[0016]表1 含有巯基的氨基酸、肽和蛋白
[0017][0018]含有巯基的化合物优选为：含有巯基的化合物优选为：含有巯基的化合物优选为：多肽、牛血清蛋白或修饰蛋白。
[0019]含有烯基叠氮基团的化合物的结构式(II)为其中，R1为烷基，芳基，R2和R3为氢，R1可选择性地被一个或多个独立的Q1基团取代：Q1为胺基，环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基，杂环芳基，
‑
OR4，
‑
S(O)
n
R5，
‑
NR6R7，
‑
SO2NR6R7，
‑
NR6SO2R5；
[0020]上述R4，R5，R6，R7可选择性地被一个或多个独立的氢，卤素，
‑
CN，
‑
OH，
‑
NH2，
‑
NO2，氧基，
‑
CF3，
‑
OCF3，
‑
CO2H，
‑
S(O)
n
H，烷基，芳基，杂芳基，环烷基，杂环烷基，杂环芳基或
‑
O
‑
烷基
取代，其中，n取自0，1或2。
[0021]结构式(II)中的R1、R4、R5和Q1还可以是包含功能分子的有机片段，如：药物分子、酶的抑制剂、受体的拮抗剂或激动剂、荧光发色分子、(多)糖基、多肽、天然产物分子、多齿配体、有机催化基团。
[0022]表2列出了本专利技术涉及的部分含有烯基叠氮基团的化合物，但不限于此表所收集的烯基叠氮化合物。
[0023]表2 部分含有烯基叠氮基团的化合物
[0024][0025]含有烯基叠氮基团的化合物优选为：含有烯基叠氮基团的化合物优选为：
丹磺酰
‑
乙烯基叠氮化物或链霉亲和素Alexa Fluor 568偶联物；
[0026]反应温度在37
‑
40℃，反应时间为10min
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于巯基
‑
烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法，其特征在于，所述方法为：将含有巯基的化合物与含有烯基叠氮基团的化合物在反应介质中反应，使含有巯基的化合物修饰为含有β
‑
羰基硫醚的化合物；反应温度为37
‑
40℃，反应时间为10min
‑
48h；含有巯基的化合物为半胱氨酸及其衍生物、含有巯基的多肽或者含有巯基的蛋白质。2.根据权利要求1所述的基于巯基
‑
烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法，其特征在于，所述半胱氨酸及其衍生物的结构式如式(I)所示：其中，P1为氢，烷基，芳基，杂芳基，
‑
(C＝O)
‑
烷基，
‑
(C＝O)
‑
芳基，
‑
(C＝O)
‑
杂芳基，
‑
(C＝O)
‑
O
‑
烷基，
‑
(C＝O)
‑
O
‑
芳基，
‑
(C＝O)
‑
O
‑
杂芳基，
‑
(C＝O)
‑
NH
‑
烷基，
‑
(C＝O)
‑
NH
‑
芳基，
‑
(C＝O)
‑
NH
‑
杂芳基，二肽基或多肽基；P2为羟基，
‑
O
‑
烷基，
‑
NH
‑
烷基，
‑
NH
‑
芳基，
‑
NH
‑
杂芳基，环胺基，
‑
NH
‑
二肽基或
‑
NH
‑
多肽基。3.根据权利要求1所述的基于巯基
‑
烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法，其特征在于，所述含有烯基叠氮基团的化合物的结构式如式(II)所示：其中，R1，R2和R3为氢，烷基，芳基，杂芳基，炔基，烯基。4.根据权利要求3所述的基于巯基
‑
烯基叠氮偶联反应的多肽或蛋白质定向修饰方法，其特征在于，所述含有烯基叠氮基团的化合物的结构式(II)中R1被一个或多个独立的Q1基团取代：Q1为氢，卤素，羟基，胺基，
‑
CN，
‑
CF3，
‑
OCF3，
‑
NO2，叠氮基，烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基，杂环芳基，
‑
OR4，
‑
S(O)
n
R5，
‑
NR6R7，
‑
SO2NR6R7，
‑
(C＝O)
‑
R5，
‑
(C＝O)
‑
NR6R7，<...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐华栋，沈美华，王雨蛟，王勇，周颖，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：