快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用。包括如下引物对中的至少两对：检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。该方法采用特异性引物组对驼乳样品中提取的样品总DNA进行多重PCR扩增，检测所述驼乳中是否含有上述五种致病菌；并且当含有目标致病菌时，确定致病菌的种类。该方法具有良好的特异性、敏感性和准确性，样品需求量少，对样品的储存和运输条件要求低。同时还具有成本低、效率高的优点。率高的优点。率高的优点。

【技术实现步骤摘要】
快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]目前，关于双峰驼乳房炎的主要致病菌准确、快速的检测方法尚未被系统建立。现有技术中，为了检测双峰驼乳房炎的方法主要是采用PCR技术依次检测可能的致病菌，或采用传统的细菌分离方法进行鉴定。然而，由于可能致病菌种类较多，这样的方法效率很低，样本需求量很大，检测成本高。
[0003]例如，目前主要采用的检测方法为细菌分离鉴定或宏基因组方法。细菌分离鉴定虽然准确性较高，但是对样品采集、保存、运输等条件的要求也比较高，且需要针对不同致病菌选择合适的分离培养基，实验周期较长，实验设备要求较高、耗费较大。而宏基因组技术虽然可以较为全面的检测样品中的细菌分布，但是费用昂贵、样品需求量较大，通常在10mL以上。同时，宏基因组的检测周期在1月以上，检测效率低不适用于临床诊治。
[0004]另外，其他的一般PCR方法的特异性和敏感性比较低，不适合检测可能由多种致病菌导致引起的双峰驼乳房炎。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，包括如下引物对中的至少两种：检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。
[0008]本专利技术还可以通过以下进一步技术方案实现：
[0009]进一步，包括检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。
[0010]进一步，所述检测大肠杆菌的引物对包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物，和如SEQ ID NO：2所示的下游引物；
[0011]所述检测金黄色葡萄球菌的引物对包括如SEQ ID NO：3所示的上游引物，和如SEQ ID NO：4所示的下游引物；
[0012]所述检测无乳链球菌的引物对包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物，和如SEQ ID NO：6所示的下游引物；
[0013]所述检测粪肠球菌的引物对包括如SEQ ID NO：7所示的上游引物，和如SEQ ID NO：8所示的下游引物；
[0014]所述检测支原体的引物对包括如SEQ ID NO：9所示的上游引物，和如SEQ ID NO：10所示的下游引物。
[0015]本专利技术提供一种试剂盒，包括如上述的引物组及辅助试剂。
[0016]本专利技术提供如上述的试剂盒在快速检测骆驼乳房炎主要致病菌中的应用。
[0017]本专利技术提供一种快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，采用上述的引物组对驼乳样品中提取的样品总DNA进行多重PCR扩增，检测所述驼乳中是否含有所述主要致病菌；并且当含有所述主要致病菌时，确定所述主要致病菌的种类。
[0018]进一步，支原体、无乳链球菌、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的最低检出浓度均为1ng/μL，粪肠球菌的最低检出浓度为10ng/μL。
[0019]进一步，包括以下步骤：
[0020]S1、取所述驼乳样品，将所述驼乳样品依次进行离心，采用水煮法提取所述样品DNA；
[0021]S2、采用所述引物组对所述样品DNA进行多重PCR扩增，得到PCR产物；
[0022]S3、将所述PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带判断所述驼乳样品中是否含有致病菌及致病菌的种类。
[0023]进一步，所述多重PCR扩增的反应体系为50μL，包括25μL的2
×
预混聚合酶、1μL的样品DNA、1μL检测金黄色葡萄球菌的上游引物、1μL检测金黄色葡萄球菌的下游引物、其他各上游引物和各下游引物分别为0.5μL,余量为ddH2O；
[0024]所述多重PCR扩增的反应程序为：预变性：98℃、5min；变性：95℃、20s；退火：58℃、30s；延伸：72℃、40s；循环数：30；终延伸：72℃、10min。
[0025]进一步，所述步骤S1中，所述驼乳样品的体积为0.5～1mL。
[0026]本专利技术的有益效果在于：
[0027](1)本专利技术的检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，对应的五种致病菌为分离率最高、危害较大的主要致病菌；该引物组含有至少两个引物对，可以检测至少两种主要致病菌，能够快速有效的实现对骆驼乳房炎的主要致病菌的检测。
[0028](2)本专利技术的特异性引物组，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体具有良好的特异性，对这些致病菌与其他致病菌也有良好的特异性。
[0029](3)本专利技术的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，采用多重PCR扩增的方法进行检测，样品需求量少，最大仅需0.5～1mL；这样不仅便于取样，而且能够降低样品量对检测方法的限制，便于对该方法进行推广和应用。
[0030](4)本专利技术的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，其采用的样品可仅通过低温保存或短时间常温保存，降低了样品保存条件，便于长距离运输。
[0031](5)本专利技术的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，采用上述引物组进行检测，敏感性高，样品中致病菌的DNA浓度大于5ng，即可得到检测结果。
[0032](6)本专利技术的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，准确率可达95.7％，是一种可靠的检测方法，能够为后续的骆驼乳房炎诊断和治疗提供了有效的依据。
[0033](7)本专利技术的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，还具有良好的特异性、效率高、成本低的优点。
附图说明
[0034]图1为本专利技术的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例1中，分别对仅含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体的DNA模板样品进行PCR扩增的电泳图；
[0035]图2为本专利技术的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例1中，分别对仅含有驼乳中普遍存在的细菌，如莫林枸橼酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯、不动杆菌、干酪溶解巨球菌、克雷伯、变形杆菌及各阳性对照组的DNA模板进行PCR扩增的电泳图；
[0036]图3为本专利技术的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例2中，对含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体的DNA模板样品进行五重PCR扩增的电泳图；
[0037]图4为本专利技术的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例3中，实验组的电泳图；
[0038]图5为本专利技术的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例4中，对各驼乳样品进行五重PCR扩增的电泳图；
[0039]图6为本专利技术的快速检测双峰驼乳房炎本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，其特征在于，包括如下引物对中的至少两对：检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。2.根据权利要求1所述一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，其特征在于，包括检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。3.根据权利要求2所述一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，其特征在于，所述检测大肠杆菌的引物对包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物，和如SEQ ID NO：2所示的下游引物；所述检测金黄色葡萄球菌的引物对包括如SEQ ID NO：3所示的上游引物，和如SEQ ID NO：4所示的下游引物；所述检测无乳链球菌的引物对包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物，和如SEQ ID NO：6所示的下游引物；所述检测粪肠球菌的引物对包括如SEQ ID NO：7所示的上游引物，和如SEQ ID NO：8所示的下游引物；所述检测支原体的引物对包括如SEQ ID NO：9所示的上游引物，和如SEQ ID NO：10所示的下游引物。4.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～3任意一项所述的特异性引物组及辅助试剂。5.如权利要求4所述的试剂盒在快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌中的应用。6.一种快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，其特征在于，采用如权利要求2或3任意一项所述的特异性引物组对驼乳样品中提...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，陈钢粮，裴文刚，李娜，苏战强，付强，储岳峰，赵红琼，许健，郭庆勇，高鹏程，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：