天冬氨酸酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种天冬氨酸酶突变体及其应用，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明专利技术提供的天冬氨酸酶突变体能够催化制备β

【技术实现步骤摘要】
天冬氨酸酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及天冬氨酸酶突变体及其在生产β
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丙氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]β
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丙氨酸(β
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alanine)，又名3
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氨基丙酸，纯品为白色棱形结晶，主要用于合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等，在医药、饲料、食品等领域应用广泛。
[0003]目前，国内外生产β
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丙氨酸的工业化方法主要采用化学合成法，包括丙烯酸氨化法、丙烯腈氨化水解法及β
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氨基丙腈水解法，国内的工业化生产主要采用丙烯腈氨化水解法。这些方法大多需要强酸强碱、高温、高压的条件，而且产物纯化步骤繁琐，同时存在腈类物质易造成环境污染。
[0004]随着β
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丙氨酸需求量的不断增加，寻求绿色的生产方法具有十分明显的经济和社会效益。酶转化法制备β
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丙氨酸具有工艺简单、纯化方便、绿色无污染的特点，该方法现已逐步成为人们研究的热点。微生物L
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天冬氨酸α
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脱羧酶使L
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天冬氨酸脱去一个CO2分子，转变成β
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丙氨酸。在此酶转化过程中，产物分子量/底物分子量＝0.67，即1kg原料天冬氨酸生产0.67kg的β
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丙氨酸。
[0005]天冬氨酸酶(L
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Aspartate ammonia
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>lyase，E.C.4.3.1.1)是一种重要的工业用酶，主要用于酶法合成L
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天冬氨酸。生物合成的原理在富马酸α
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位进行氨基加成生成L
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天冬氨酸。
[0006]专利(CN109385415B，CN110923272B)所涉及的酶转化法制备β
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丙氨酸，使用的酶为来源于芽孢杆菌天冬氨酸酶突变体。原料为丙烯酸，此类酶定向加成氨基制备β
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丙氨酸，产物分子量/底物分子量＝1.24，即1kg原料丙烯酸生产1.24kg的β
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丙氨酸。上述专利方法中酶所介导的氨基加成反应的最适温度在35℃～55℃之间。
[0007]因此，需要开发新的方法和菌株，以期提高生产β
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丙氨酸的量。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供天冬氨酸酶突变体，并利用此突变体在20
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25℃下催化丙烯酸制备β
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丙氨酸。
[0009]第一方面，本专利技术提供天冬氨酸酶突变体，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或多个：Q130E(第130位谷氨酰胺变为谷氨酸)、N217Q(第217位天冬酰胺变为谷氨酰胺)、R220K(第220位精氨酸变为赖氨酸)、I268L(第268位异亮氨酸变为亮氨酸)；其中，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]作为一个具体的实施方案，本专利技术所述天冬氨酸酶突变体具有：(1)：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。
[0011]第二方面，本专利技术提供编码所述天冬氨酸酶突变体的核酸分子，所述核酸分子：
(1)由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。
[0012]作为一个具体的实施方案，本专利技术所述核酸分子与SEQ ID NO.5的核苷酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％以上同源性的序列。
[0013]第三方面，本专利技术提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有所述的核酸分子。
[0014]第四方面，本专利技术提供一种能够生产β
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丙氨酸的重组菌，所述重组菌含有所述的重组表达载体。
[0015]作为一个具体的实施方案，所述重组菌为重组大肠杆菌(Escherichia Coli)；优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)菌株。
[0016]第五方面，本专利技术提供所述的天冬氨酸酶突变体、所述的核酸分子、所述的重组表达载体、所述的重组菌在生产β
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丙氨酸中的应用。
[0017]第六方面，本专利技术提供所述的天冬氨酸酶突变体、所述的核酸分子、所述的重组表达载体、所述的重组菌用于催化生产β
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丙氨酸的方法。
[0018]第七方面，本专利技术提供一种合成β
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丙氨酸的方法，包括如下步骤：将底物与所述天冬氨酸酶突变体接触，或者与表达所述天冬氨酸酶突变体的宿主细胞接触，进行催化反应，生成β
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丙氨酸。
[0019]其中，所述底物为丙烯酸。
[0020]其中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)。
[0021]其中，所述反应条件为：底物丙烯酸浓度0.5M～5.0M，所述天冬氨酸酶突变体的浓度为3g/L～20g/L，反应pH值为pH7.0～pH8.0，反应温度为15℃～30℃，反应时间为0.1h～5h。
[0022]在一些实施方案中，所述底物丙烯酸的浓度可以为，例如，0.5M、0.8M、1.0M、1.3M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M或5.0M。优选的浓度范围可以为0.5M～3.0M，更优选的浓度范围可以为0.8M～2.0M。
[0023]在一些实施方案中，所述天冬氨酸酶突变体的浓度可以为，例如，3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L或20g/L。
[0024]在一些实施方案中，反应pH值可以为，例如，7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。
[0025]在一些实施方案中，反应温度可以为，例如，15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。优选的温度范围为15℃～25℃，更优选的温度范围为17℃～25℃，甚至更优选的温度范围为20℃～25℃。
[0026]丙烯酸由于含有双键，容易发生二聚反应，该反应是自发反应，并随着温度的升高而加快。在温度低于13℃的条件下，丙烯酸发生凝结反应；丙烯酸在15℃～25℃较为稳定，不易发生聚合反应。因此，在由酶介导的丙烯酸氨基加成反应生产β
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丙氨酸过程中，酶促反应在15℃～25℃之间为最适温度，丙烯酸的转化率可达83％以上。令人惊奇的是，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种天冬氨酸酶突变体，其特征在于，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或多个：Q130E、N217Q、R220K、I268L；其中，所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于，所述天冬氨酸酶突变体具有：(1)：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。3.编码权利要求1所述天冬氨酸酶突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子：(1)由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求3所述的核酸分子。5.一种能够生产β
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丙氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求4所述的重组表达载体。6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组大肠杆菌(Escherichia Coli)。7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐斌，汪本助，方国康，卓雪瑞，周伯楠，周娜娜，赵亚飞，常凯丽，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：