一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及RAA法，具体涉及一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括引物和探针，该方法特异性良好，检测灵敏度为0.0696ng/剂量，满足《中国药典》2020年版三部中规定的狂犬疫苗原液中残留DNA应不高于3ng/剂量的检测要求。留DNA应不高于3ng/剂量的检测要求。留DNA应不高于3ng/剂量的检测要求。

【技术实现步骤摘要】
一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及RAA法，具体涉及一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。该细胞系由日本千叶大学的Yasumura和Kawakita于1962年3月27日扩增出来；Vero细胞被广泛应用于病毒感染分子机制研究、疫苗及重组蛋白的生产，世界卫生组织甚至认可其作为疫苗生产细胞系，建议将其作为流感疫苗生产的替代基质。近年来，我国多采用Vero细胞培养狂犬疫苗，与原代细胞相比，Vero细胞的传代细胞效果更好，质量更高，成本更低，但因传代细胞调控生长的基因失调，使其具有无限的寿命，从而存在着潜在的安全风险。因此需要对Vero细胞培养的狂犬疫苗中残留DNA进行监测，确保其在安全范围内，从而保证疫苗的安全性与可靠性。
[0003]我国监管部门关于残留DNA的限度要求主要参考WHO、FDA及欧洲的指南，在《中国药典》2020版《人用重组单克隆抗体制品总论》工艺相关杂质部分提出应采用适宜的方法对供试品中宿主细胞和载体DNA进行检测，要求测定结果应在规定的范围内，如对于Vero细胞培养的疫苗中残留DNA应不高于50pg/剂量。此外，《中国药典》2020年版三部在《人用基因治疗制品总论》中明确提取和纯化工艺应保证将制品的一些特定工艺杂质去除或降至可接受的水平，其中特定工艺杂质包括表达载体的核酸和宿主细胞的DNA。
[0004]2006年，Piepenburg等人首次报道重组酶等温扩增技术，该技术不依赖于热循环仪，无需温控设备，在常温下即可完成扩增，且扩增速度较快，10
‑
20分钟即可判定扩增结果，可真正实现便携式核酸快速检测。目前，重组酶等温扩增技术包括重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)和重组酶介导的核酸扩增技术(Recombinase mediated acid amplification,RAA)两种，其区别在于RPA是噬菌体重组酶而RAA是细菌或真菌中获得的重组酶，因RAA中的重组酶来源广泛，且具有我国自主知识产权，现应用较多。该技术主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(single
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stranded binding protein，SSB)和DNA聚合酶。然后在一些辅助成分，如重组酶加载因子，dNTP，三磷酸腺苷(ATP)，高分子量聚乙二醇，盐分子等的配合下完成整个反应。反应开始时，重组酶在加载因子的辅助下与引物结合形成重组酶引物复合体，形成的复合体在双链DNA中寻找同源序列，定位后入侵双链DNA，形成D
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环结构，双链DNA解开，单链结合蛋白(SSB)结合被置换的DNA链，防止引物解离。随后，重组酶引物复合体中的重组酶被水解，引物的3'
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端暴露并与DNA聚合酶(Bsu或Sau)结合，开始DNA链的合成。最终，两条母链分离，得到两条新的互补双链，水解后的重组酶可立即与新的引物结合从而启动另一条链置换反应。以上过程的重复进行使DNA扩增呈指数型积累。
[0005]重组酶等温介导核酸扩增技术作为一种新型核酸体外扩增技术，其具有冻干颗粒易于储存和运输、反应时间快、无需严格温度控制、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，
近年来得到了较快的发展，广泛应用于细菌，病毒，寄生虫，食品安全等领域。但其作为一种新技术，在分析检测及现场应用过程中仍存在样品处理复杂，易受环境交叉污染等制约，针对这些问题，研究人员采取了新措施。如等温扩增微流控检测技术通过微流控技术与核酸等温扩增技术的结合，简化了实验步骤，实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化，适合于在多种环境下的病原微生物快速检测。此外，开发便携式和全自动等温扩增设备也是至关重要的，它们不仅可以进一步提高检测效率，而且可以在低资源环境和疾病突发地等得到及时应用。随着不断的发展与优化，重组酶等温介导核酸扩增技术有望得到更加广泛的应用。
[0006]综合国内外监管机构对生物制品中宿主细胞残留DNA的严格要求，可知生物制品中宿主细胞残留DNA的潜在危害是不容小觑。《中国药典》2020版已收载三种方法用于外源性残留DNA的检测，其中较为常用方法的为qPCR技术，该方法不仅可准确定量，且灵敏度较高可达到fg级，大大提高检测的准确性。但因其需精密和昂贵的qPCR仪、相关检测试剂盒价格较高，较难在基层及偏远地区实施，且其有着复杂的样品前处理和相对较长的检测时间，应用于快检的难度比较大。因此，加强残留DNA检测的相关技术的开发将具有十分重要的意义。重组酶等温介导核酸扩增所需设备简单便于携带，而且有着高效、高灵敏度、高特异性等的特点，既可实验室检测，又可用于现场快检及基层检测。其中的RAA技术已在致病微生物鉴定等领域得到了广泛的应用，且处在不断的发展与完善中，有着广阔的应用前景。该方法有望替代现有残留DNA检测方法或成为现有方法的有益补充，应用于不同产品或产品不同阶段DNA残留的检测，提高检测效率，降低检测成本，从而为新药研发人员提供新的研究思路，为监管人员提供新的监管手段。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术提供一种一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒。
[0008]技术方案
[0009]一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒，其特征在于包括
[0010]引物：
[0011]F2
‑5’‑
CTGGACAGAAGCTCTCTGAGACACTGCTCTGTG
‑3’
[0012]R2
‑5’‑
CGATGCTTCTCTCCAGTTCTGAACGGAAGATAT
‑3’
[0013]探针P1：5
’‑
GAGTTACATCTCTACCTTCAAGAAGCCTT(FAM
‑
dt)CG(THF)(BHQ1
‑
dt)AAGGCTGTTCTTGTG
‑
(3
’‑
phosphate)。
[0014]所述的试剂盒，其特征在于其还含有包括装有反应干粉的检测单元管，反应缓冲液，醋酸镁，阳性对照；反应干粉是采用为低温冷冻干燥技术获得的冻干粉末，主要成分为重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、dNTPs和ATP；反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为300mM的Tris
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HCl缓冲液pH＝8.0、120mM醋酸钾和质量分数为20％的PEG 20000。
[0015]所述的一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒的检测方法，其特征在于将装有权利要求2所述的冻干粉反应管中加入：上游引物10引物干粉反应管中，下游引物10游引物粉反应管中，探针10针引物粉反应管中，反应缓冲液25应缓，双蒸水15.7冲液，模板2模板以及醋酸镁280mmo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒，其特征在于包括引物：F2
‑5’‑
CTGGACAGAAGCTCTCTGAGACACTGCTCTGTG
‑3’
R2
‑5’‑
CGATGCTTCTCTCCAGTTCTGAACGGAAGATAT
‑3’
探针P1：5
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GAGTTACATCTCTACCTTCAAGAAGCCTT（FAM
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dt）CG(THF)(BHQ1
‑
dt)AAGGCTGTTCTTGTG
‑
(3
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phosphate)。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵述强，高巾媛，陆益红，庞庆林，严方，史清水，
申请(专利权)人：江苏省食品药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：