高通量简化噬菌体基因组骨架的方法技术

本申请涉及生命科学技术领域，提供了一种高通量简化噬菌体基因组骨架的方法。所述方法包括如下步骤：设计并合成噬菌体的CiPGr序列文库，将CiPGr序列文库与pTarget质粒骨架组装，形成CiPGr质粒文库；将CiPGr质粒进行转化后提取CiPGr质粒；将CiPGr质粒转化进入含有spCas9质粒的宿主细菌中，得到CiPGr质粒

【技术实现步骤摘要】
高通量简化噬菌体基因组骨架的方法


[0001]本申请涉及生命科学
，具体涉及一种高通量简化噬菌体基因组骨架的方法。

技术介绍

[0002]噬菌体是地球上最丰富、最具基因多样性的生物体。在一个多世纪的时间里，噬菌体研究一直是许多生物发现的关键，它为分子生物学提供了重要的生物技术工具。近年来，病毒宏基因组测序显示，在人类肠道和其他环境中发现了大量噬菌体序列。这些序列的大部分(＞75％)是新型的，超过95％的序列属于有尾双链(ds)DNA噬菌体。此外，噬菌体已被认为是潜在的治疗细菌感染的天然抗菌药物。但同时，噬菌体作为潜在的治疗细菌感染的天然抗菌药物存在的宿主特异性、容易产生抗性等问题，直接影响噬菌体的成药性。因此，科研工作者对噬菌体进行了许多合成生物学方面的努力，以克服这些限制。
[0003]无尾噬菌体如M13和X174，具有非常紧凑和较小的基因组(＜10kb)，由于编码有限数量的基因相对简单，使其易于编辑和理解其基因的功能。而有尾噬菌体的基因组通常数量相对较大(14～500kbp)且呈异常多样化，这使得大规模获得有尾噬菌体简化基因组存在较大挑战性。其中一个挑战是：在基因组规模内，没有有效的方法来识别噬菌体的非必需基因。比如模式噬菌体T7的25个非必需基因，是从最近三四十年的大量研究中积累知识中获得的。噬菌体的扩增完全依赖其宿主，其独特的自我传播特性，使得在细菌中广泛使用的方法(在微生物如大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌和支原体中广泛应用的简化基因组方法，如同源重组、Tn5突变等)可能不适合大规模在有尾噬菌体中应用。此外，由于噬菌体基因组的高度多样性的特征，使得通过生物信息方法比对很难获得非必需基因信息。
[0004]从头合成简化基因组，需要高通量鉴定噬菌体的非必需基因，但高通量鉴定方法如dCas9方法，有两个原因导致失败：一是由于噬菌体基因组在细菌中会复制很多份，使许多噬菌体基因组的基因表达不能完全被dCas9抑制，导致假阳性结果；第二，噬菌体的基因很多是串联转录的，dCas9抑制上游基因,将导致所有下游基因的抑制表达，导致了假阴性的结果。而Tn5类似的转座子方法同样由于噬菌体独特的生长方式而导致鉴定效率下降。

技术实现思路

[0005]本申请的目的在于提供一种高通量简化噬菌体基因组骨架的方法，旨在解决简化噬菌体基因组的方法复杂，效率低的问题。
[0006]为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
[0007]一种高通量简化噬菌体基因组骨架的方法，包括如下步骤：
[0008]设计并合成两种或两种以上噬菌体的多个CiPGr序列文库，将各所述CiPGr序列文库中分别与pTarget质粒骨架组装，形成CiPGr质粒文库；其中，所述CiPGr序列文库包括n个CiPGr序列，n为大于或等于2的自然数，所述CiPGr序列包含gRNA，且各所述CiPGr序列的gRNA不同；
[0009]将所述CiPGr质粒文库中的CiPGr质粒进行转化，筛选含有所述CiPGr质粒的转化态细胞，从所述转化态细胞中提取所述CiPGr质粒；将所述CiPGr质粒转化进入含有spCas9质粒的宿主细菌中，得到CiPGr质粒
‑
细菌文库，所述CiPGr质粒
‑
细菌文库中含有n种CiPGr质粒
‑
细菌；
[0010]将野生型噬菌体和对应的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库在培养基中培养，取突变噬菌体产物转移到新鲜的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库中继续培养，重复迭代培养，生成突变噬菌体库；
[0011]对间隔一定转移次数后得到的突变噬菌体库进行测序，确认所述噬菌体中的所有可删除基因。
[0012]在一个实施例中，所述突变噬菌体库的生成步骤为：
[0013]将所述野生型噬菌体和对应的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库在培养基中培养，生成第一代突变噬菌体产物，离心所述第一代突变噬菌体产物，取上清液，得到第一代突变噬菌体库；将部分所述第一代突变噬菌体文库和新鲜的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库培养基中继续培养，生成第二代突变噬菌体产物，离心所述第二代突变噬菌体产物，取上清液，得到第二代突变噬菌体库；将部分所述第二代突变噬菌体库和新鲜的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库在培养基中培养，生成第三代突变噬菌体产物，离心所述第三代突变噬菌体产物，取上清液，得到第三代突变噬菌体库；重复该迭代培养的步骤，使转移次数达到300～600次，收集各突变噬菌体库。
[0014]在一个实施例中，所述方法还包括筛选单种具有活性的突变噬菌体。
[0015]在一个实施例中，所述筛选单种具有活性的突变噬菌体，包括：
[0016]将1
×
103～5
×
103PFU的突变噬菌体库与野生型宿主细胞在固态培养基中培养，随机挑选若干大菌斑和小菌斑进行分离纯化；将过夜培养的宿主细胞和新鲜LB培养基加入到96孔板中，加入单种突变噬菌体后，在酶标仪上培养，每隔一段时间检测一次OD
600
，持续12～24小时；根据杀菌曲线选择突变噬菌体，并通过划板法对所选择的所述突变噬菌体进行进一步纯化。
[0017]在一个实施例中，所述方法还包括筛选优势突变噬菌体，步骤包括：
[0018]把所述突变噬菌体库中的突变噬菌体混合后，与野生型宿主细胞共培养后，转移到新鲜的野生型宿主细胞中再次培养，重复“转移到新鲜的野生型宿主细胞中再次培养”的步骤N
‑
1次，得到TN突变噬菌体；
[0019]将1
×
103～5
×
103PFU的TN突变噬菌体、野生型宿主细胞和LB琼脂混合后倒入LB平板，培养过夜；
[0020]挑选不同的噬菌斑进行纯化后，将过夜培养的宿主细胞和新鲜LB培养基加入到96孔板中，并将单个斑块提纯后转移到96孔板中，在酶标仪上培养，并且每隔一段时间检测一次OD
600
，持续12～24小时；根据杀菌曲线括筛选优势突变噬菌体。
[0021]在一个实施例中，所述方法还包括所述噬菌体中非必需基因、准必需基因和必需基因的确定。
[0022]在一个实施例中，所述噬菌体中非必需基因、准必需基因和必需基因的确定，包括：
[0023]分析所述突变噬菌体文库中突变噬菌体的缺失基因的概率，缺失频率＜5％的可
删除基因确定为所述噬菌体的准必需基因，缺失频率＞5％的可删除基因确定为所述噬菌体的非必需基因，未检测到删除的基因确定为所述噬菌体的必需基因。
[0024]在一个实施例中，所述CiPGr序列还包含条形码、两条同源臂、启动子和引物。
[0025]在一个实施例中，将所述CiPGr质粒文库中的CiPGr质粒转化后，筛选含有所述CiPGr质粒的转化态细胞，从所述转化态细胞中提取所述CiPGr质粒，包括：
[0026]将所述CiP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量简化噬菌体基因组骨架的方法，其特征在于，包括如下步骤：设计并合成两种或两种以上噬菌体的多个CiPGr序列文库，将各所述CiPGr序列文库中分别与pTarget质粒骨架组装，形成CiPGr质粒文库；其中，所述CiPGr序列文库包括n个CiPGr序列，n为大于或等于2的自然数，所述CiPGr序列包含gRNA，且各所述CiPGr序列的gRNA不同；将所述CiPGr质粒文库中的CiPGr质粒进行转化，筛选含有所述CiPGr质粒的转化态细胞，从所述转化态细胞中提取所述CiPGr质粒；将所述CiPGr质粒转化进入含有spCas9质粒的宿主细菌中，得到CiPGr质粒
‑
细菌文库，所述CiPGr质粒
‑
细菌文库中含有n种CiPGr质粒
‑
细菌；将野生型噬菌体和对应的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库在培养基中培养，取突变噬菌体产物转移到新鲜的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库中继续培养，重复迭代培养，生成突变噬菌体库；对间隔一定转移次数后得到的突变噬菌体库进行测序，确认所述噬菌体中的所有可删除基因。2.根据权利要求1所述的高通量简化噬菌体基因组骨架的方法，其特征在于，所述突变噬菌体库的生成步骤为：将所述野生型噬菌体和对应的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库在培养基中培养，生成第一代突变噬菌体产物，离心所述第一代突变噬菌体产物，取上清液，得到第一代突变噬菌体库；将部分所述第一代突变噬菌体文库和新鲜的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库培养基中继续培养，生成第二代突变噬菌体产物，离心所述第二代突变噬菌体产物，取上清液，得到第二代突变噬菌体库；将部分所述第二代突变噬菌体库和新鲜的所述CiPGr质粒
‑
细菌文库在培养基中培养，生成第三代突变噬菌体产物，离心所述第三代突变噬菌体产物，取上清液，得到第三代突变噬菌体库；重复该迭代培养的步骤，使转移次数达到300～600次，收集各突变噬菌体库。3.根据权利要求1所述的高通量简化噬菌体基因组骨架的方法，其特征在于，所述方法还包括筛选单种具有活性的突变噬菌体。4.根据权利要求3所述的高通量简化噬菌体基因组骨架的方法，其特征在于，所述筛选单种具有活性的突变噬菌体，包括：将1
×
103～5
×
103PFU的突变噬菌体库与野生型宿主细胞在固态培养基中培养，随机挑选若干大菌斑和小菌斑进行分离纯化；将过夜培养的宿主细胞和新鲜LB培养基加入到96孔板中，加入单种突变噬菌体后，在酶标仪上培养，每隔一段时间检测一次OD
600
，持续12～24小时；根据杀...

【专利技术属性】
技术研发人员：马迎飞，袁盛建，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：