羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将羊水间充质干细胞的培养上清低速离心，收集上清，获得粗提物；将粗提物在12000g～15000g的条件下离心10分钟～15分钟后，取上清并使用0.22μm滤膜过滤，获得滤液；将沉淀剂与滤液按照体积比1：(1～2)混合后静置，其中沉淀剂包括聚乙二醇、氯化钠和水，在100mL的沉淀剂中，聚乙二醇的质量为12g～50g，氯化钠的质量为5g～10g，聚乙二醇为PEG6000和PEG8000中的至少一种；静置后，在12000g～15000g条件下离心70分钟～90分钟后弃上清，获得羊水间充质干细胞的细胞外囊泡。细胞外囊泡。细胞外囊泡。

【技术实现步骤摘要】
羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称。根据其直径不同，可分为4个亚群：微粒、凋亡小体、癌小体(oncosomes)和外泌体。微粒也叫核外颗粒体(microvesicles/ectosomes)，直径为100～1000nm。凋亡小体(apoptotic body/bleb)是细胞凋亡过程中产生的直径约为50～5 000nm的囊泡。癌小体是最新发现的类别，直径为1～10μm，已在癌细胞中观察到。外泌体(exosomes)直径为30～150nm，密度为1.13g/mL～1.19g/mL，有典型的“杯盘”形态，外泌体几乎可由所有种类的细胞分泌，并存在于人体各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、羊水、腹水、汗液以及月经血，通常1mL血液中存在1
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个外泌体。细胞外囊泡携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控，在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
[0003]2003年Prusa等人首次证明了人类羊水中存在干细胞。羊水来源的间充质干细胞(amniotic fluid
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mesenchymal stem cellstem cells，AF
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MSCs，简称羊水间充质干细胞)在含有血清(或者血清类似物)的培养基条件中，可以贴壁于培养皿的底部，呈长梭样，并快速增殖。羊水间充质干细胞表达CD73、CD90、CD147和CD44，不表达CD34、CD14和CD45，在特定的诱导环境下，可以分化成软骨、骨和脂肪。羊水间充质干细胞来源的细胞外囊泡可以抑制过激的免疫反应，具有广泛的临床应用前景。
[0004]目前，常用的羊水间充质干细胞的细胞外囊泡分离方法是超速离心法，但超速离心法获得的细胞外囊泡中的蛋白的含量较少。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种的能够提高细胞外囊泡中蛋白含量的羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法。此外，还提供一种蛋白含量较高的羊水间充质干细胞来源的细胞外囊泡。
[0006]一种羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0007]将羊水间充质干细胞的培养上清在300g～500g的条件下离心，收集上清，获得粗提物；
[0008]将所述粗提物在12000g～15000g的条件下离心10分钟～15分钟后，取上清并使用0.22μm滤膜过滤，获得滤液；
[0009]将沉淀剂与所述滤液按照体积比1：(1～2)混合均匀，获得混合液，所述沉淀剂包括聚乙二醇、氯化钠和水，在100mL的所述沉淀剂中，所述聚乙二醇的质量为12g～25g，所述
氯化钠的质量为5g～10g，所述聚乙二醇为PEG6000和PEG8000中的至少一种；及
[0010]将所述混合液在2℃～10℃条件下静置2小时以上后，在12000g～15000g条件下离心70分钟～90分钟后弃上清，获得羊水间充质干细胞的细胞外囊泡。
[0011]上述羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法通过先将羊水间充质干细胞的培养上清低速离心去除细胞杂质后高速离心，并将上清过0.22μm滤膜后所得的滤液与沉淀剂作用，最后经高速离心而获得细胞外囊泡。与传统的超速离心法相比，上述的羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法获得的细胞外囊泡不仅粒径分布无明显差异，而且其蛋白含量高、颗粒多、miRNA
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5p含量高。此外，与传统的超速离心法相比，上述的羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法对设备的要求更低，离心力不超过15000g(传统的超速离心法的为超速离心，离心力一般在100000g以上)。
[0012]在其中一个实施例中，在100mL的所述沉淀剂中，所述聚乙二醇的质量为16g～25g，所述氯化钠的质量为5.5g～8g。
[0013]在其中一个实施例中，所述沉淀剂与所述滤液的体积比为1：(1～5)。
[0014]在其中一个实施例中，在获得所述滤液的步骤中，离心的条件为：离心力为12000g～14000g，离心时间为10分钟～12分钟。
[0015]在其中一个实施例中，在获得所述粗提物的步骤中，离心的条件为：离心力为300g～400g，离心时间为5分钟～10分钟。
[0016]在其中一个实施例中，所述混合液的静置时间为2小时～12小时；
[0017]和/或，所述混合液的静置温度为3℃～6℃。
[0018]在其中一个实施例中，静置后的所述混合液的离心条件为：离心力为12000g～15000g，离心时间为70分钟～80分钟。
[0019]在其中一个实施例中，在将所述混合液离心并弃上清之后，还包括将离心获得的沉淀采用缓冲液重悬后再次离心并收获沉淀的步骤。
[0020]在其中一个实施例中，所述再次离心的离心条件为：离心力为12000g～15000g，离心时间为30分钟～50分钟。
[0021]一种细胞外囊泡，采用上述的羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法制得。
附图说明
[0022]图1为实施例1中体外培养的第3代的羊水间充质干细胞；
[0023]图2为实施例1中超速离心法获得的细胞外囊泡的电镜图；
[0024]图3为实施例1中聚乙二醇法获得的细胞外囊泡的电镜图；
[0025]图4为实施例1中超速离心法获得的细胞外囊泡的粒径分布情况；
[0026]图5为实施例1中聚乙二醇沉淀法获得的细胞外囊泡的粒径分布情况；
[0027]图6为实施例1中应用流式细胞仪分析的超速离心法与聚乙二醇沉淀法获得的细胞外囊泡的分子标记表达情况；
[0028]图7为实施例1中的超速离心法与聚乙二醇沉淀法获得的细胞外囊泡中miRNA
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5p的含量及应用流式细胞仪分析的超速离心法与聚乙二醇沉淀法获得的细胞外囊泡中蛋白含量、颗粒量及粒径分布。
具体实施方式
[0029]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。
[0030]实施例中使用的术语仅用于说明特定实施例，并非用于限定实施例。在本说明书中，“包括”或者“具有”等术语用于表达存在说明书中所记载的特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，并不排除还具有一个或以上的其他特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，或者附加功能。术语“一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羊水间充质干细胞的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将羊水间充质干细胞的培养上清在300g～500g的条件下离心，收集上清，获得粗提物；将所述粗提物在12000g～15000g的条件下离心10分钟～15分钟后，取上清并使用0.22μm滤膜过滤，获得滤液；将沉淀剂与所述滤液按照体积比1：(1～2)混合均匀，获得混合液，所述沉淀剂包括聚乙二醇、氯化钠和水，在100mL的所述沉淀剂中，所述聚乙二醇的质量为12g～25g，所述氯化钠的质量为5g～10g，所述聚乙二醇为PEG6000和PEG8000中的至少一种；及将所述混合液在2℃～10℃条件下静置2小时以上后，在12000g～15000g条件下离心70分钟～90分钟后弃上清，获得羊水间充质干细胞的细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在100mL的所述沉淀剂中，所述聚乙二醇的质量为16g～25g，所述氯化钠的质量为5.5g～8g。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂与所述滤液的体积比为1：(1～1.5)。4.根据权利要求1所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鼎，谢英俊，孙筱放，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心，广州柔济医院，
类型：发明
国别省市：