一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺制造技术

本发明专利技术提供一种L

【技术实现步骤摘要】
一种L
‑
丙氨酸高效酶转化及其提取工艺


[0001]本专利技术属于氨基酸生产
，涉及一种L
‑
丙氨酸高效酶转化及其提取工艺。

技术介绍

[0002]L
‑
丙氨酸（L
‑
alanine， L
‑
Ala）又名 L
‑2‑
氨基丙酸，是一种具有重要生理功能的非必需氨基酸，在食品、医药等领域具有广泛的应用。食品应用方面，L
‑
丙氨酸具有甜味与鲜味，被用于食品添加剂，改善食品风味并强化营养，此外其还具有较强的防腐保鲜功能，被用作防腐剂。医药应用方面，L
‑
丙氨酸是复合氨基酸注射液的组成成分之一，是合成维生素 B5、维生素 B6、L
‑
氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星）和抗癌药 4
‑
羟基水杨醛丙氨酸合锌的前体物质。此外，L
‑
丙氨酸可用于合成具有光学活性的聚合物，在生物医学、液晶、手性催化等领域具有重要的价值。
[0003]L
‑
丙氨酸可以通过提取法、化学合成法和生物转化法进行制备。其中，酶法转化是目前工业上的主要生产方法，即利用 L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶（L
‑
aspartate
‑
β
‑
decarboxylase，Asd）以 L
‑
天冬氨酸（L
‑
aspartic acid，L
‑
Asp）为原料经脱羧生成 L
‑
丙氨酸。在该工艺中，提高酶转化效率是L
‑
丙氨酸生产工艺中的关键，直接影响L
‑
丙氨酸的提取及得率。同时，由于培养液中含有许多杂质，L
‑
丙氨酸在培养液中结晶，所得L
‑
丙氨酸晶体不仅包含培养基杂质，还会包埋未转化的L
‑
天冬氨酸，使产品质量大打折扣，不能满足高端客户对医药级产品的需求。因此，通过对所得L
‑
丙氨酸酶转化过程及重结晶工艺进行研究，得到了一种L
‑
丙氨酸高效酶转化及其提取工艺。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种L
‑
丙氨酸高效酶转化及其提取工艺，提高了酶转化效率和产品的品质，满足了高端客户对医药级产品的需求，值得推广应用。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：一种L
‑
丙氨酸高效酶转化及提取工艺，产L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶的睾丸酮丛毛单胞菌HY
‑
08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L
‑
天冬氨酸，加入细胞通透剂EDTA和吐温
‑
80，加入酶稳定剂磷酸吡哆醛，转化培养，L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶酶活达到55000~70000 U。培养液经过脱色、重结晶、干燥得到成品L
‑
丙氨酸，得到的L
‑
丙氨酸纯度达99%以上，透光率达98%以上，比旋光度[]D20
为+14.5
º
~ +15.0
º
。
[0006]其具体操作步骤为：（1）游离细胞培养液制备取本单位一株睾丸酮丛毛单胞菌HY
‑
08D菌株活化并进行高密度发酵培养，获得游离细胞培养液，测定酶活力为45000~58000 U。取1 L游离细胞培养液进行后续酶转化反应。睾丸酮丛毛单胞菌HY
‑
08D的保藏编号为:CGMCC No.6083。
[0007]（2）游离细胞培养液活化向上述游离细胞培养液中加入细胞通透剂，细胞通透剂为EDTA和吐温
‑
80。EDTA的
加入量为0.5%~1.5%，吐温
‑
80的加入量为0.05%~0.2%，然后加入L
‑‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶稳定剂，稳定剂为磷酸吡哆醛，加入量为0.1~1.0 mM。调整pH为6.0，测定酶活力为55000~70000 U。
[0008]（3）酶转化反应直接向步骤（2）游离细胞培养液中添加固体L
‑
天冬氨酸，采用pH自动控制加液系统，在线监控反应pH值，通过PID控制器自动补加L
‑
天冬氨酸，严格控转化液 pH在5.5
‑
6.0之间，进行酶转化反应。L
‑
丙氨酸的等电点pI=6.02，在整个酶转化过程中L
‑
丙氨酸晶体不断析出，本工艺最终L
‑
天冬氨酸转化率可达400~450%。
[0009]（4）脱色将步骤（3）获得的转化液过滤收集粗晶体，用去离子水溶解，调整pH 4.5~5.0、温度50~55 ℃、L
‑
丙氨酸浓度为15%~18%，加入加入量为0.8~1.0% ZX
‑
303活性炭脱色20~25 min，脱色率可达82.0%以上。
[0010]（5）重结晶将经净化处理的L
‑
丙氨酸溶液pH调整至6.0，进行真空蒸发结晶，温度50~70 ℃，真空度
‑
0.05~0.08 MPa。将获得的L
‑
丙氨酸晶体，离心，干燥得到成品L
‑
丙氨酸，纯度达99%以上。
[0011]L
‑
丙氨酸产品分析：透光率达98%以上（c=5，水），比旋光度[
ɑ
]D20
介于+14.5
º
~ +15.0
º
之间（c=10，5 N HCl）。
[0012]上述酶活测定：Warburg呼吸仪主室：2 mL 10 mmol/L的L
‑
Asp溶液和1mL 1 mol/L的醋酸缓冲溶液（pH 5.5），Warburg呼吸仪侧室：0.5 mL发酵液，50 ℃平衡10 min， 倒入发酵液，测定10 min内释放的二氧化碳微升数V。
[0013]酶活力计算：X=V/[0.5
×
(10/60)]V为反应10 min内释放的二氧化碳微升数；0.5为发酵液体积，单位mL10/60为反应时间10 min换算为h酶活力定义：50 ℃，pH 5.5时，每毫升发酵液每小时从L
‑
Asp中脱羧释放1μL二氧化碳的酶量定义为一个活力单位，以U表示。
[0014]转化液吸光度（OD）测定：分光光度法，纯水作参比，10 mm光程，波长550 nm。
[0015]上述脱色率（%）= [脱色前转化液的吸光度
‑
脱色后转化液的吸光度]/ 脱色前转化液的吸光度
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
‑
丙氨酸高效酶转化及提取工艺，包括游离细胞法酶转化反应、脱色、重结晶等步骤，其特征在于：产L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶的睾丸酮丛毛单胞菌HY
‑
08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L
‑
天冬氨酸，加入细胞通透剂EDTA和吐温
‑
80，加入酶稳定剂磷酸吡哆醛，转化培养，L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶酶活达到55000~70000 U，培养液经过脱色、重结晶、干燥得到成品L
‑
丙氨酸。2.根据权利要求1所述的L
‑
丙氨酸高效酶转化及提取工艺，其特征在于：具体操作步骤为：（1）游离细胞培养液制备取本单位一株睾丸酮丛毛单胞菌HY
‑
08D菌株活化并进行高密度发酵培养，获得游离细胞培养液，测定酶活力为45000~58000 U，取1 L游离细胞培养液进行后续酶转化反应，所述睾丸酮丛毛单胞菌HY
‑
08D菌株保藏编号为:CGMCC No.6083；（2）游离细胞培养液活化向上述游离细胞培养液中加入细胞通透剂，细胞通透剂为EDTA和吐温
‑
80；然后加入L
‑‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶稳定剂，稳定剂为磷酸吡哆醛，调整pH为6.0，测定酶活力为55000~70000 U；（3）酶转化反应直接向步骤（2）游离细胞培养液中添加固体L...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨奕，徐慧，陈玲玲，刘建军，田延军，姜国政，王珊珊，黄艳红，韩延雷，李瑞国，
申请(专利权)人：山东省食品发酵工业研究设计院，
类型：发明
国别省市：