用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系制造技术

本申请涉及用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系，涉及基因检测技术领域，其包括靶标引物探针与内参引物探针；所述靶标引物探针序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；所述内参引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9。本发明专利技术的反应体系引物探针特异性良好、灵敏度高、适用样本范围广等为快速准确检测T790M和C797S突变频率及顺反式提供了一种很好的方法。法。

【技术实现步骤摘要】
用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系


[0001]本申请涉及基因检测
，尤其是涉及用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系。

技术介绍

[0002]表皮生长因子受体简称为EGFR，本身具有酪氨酸激酶活性，一旦与表皮生长因子(EGF)组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌的EGFR表达增高。
[0003]EGFR基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，编码跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，TK)活性，负责将胞外信号传递至胞内。由于EGFR的酪氨酸激酶活性，可以调节细胞的生长、增殖，分化，迁移，并且与肿瘤的发生有关。EGFR基因突变是东亚人群中非小细胞肺癌患者(NSCLC)最常见的驱动基因突变，发生率为30％
～
40％。既往多项研究支持EGFR
‑
酪氨酸激酶抑制剂(TKI)单药治疗是EGFR基因突变局部晚期或转移NSCLC患者的标准治疗方案，但大多数患者会在用药后9
～
14个月发生耐药，其中EGFR基因第20号外显子发生错义突变(即T790M突变)是耐药突变中最主要的类型。
[0004]第3代EGFR
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TKI药物以奥希替尼(osimertinib/AZD9291)为代表，能够靶向EGFR的激活突变位点及T790M，竞争性结合EGFR
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酪氨酸激酶催化区域上的ATP结合位点，阻断其信号传递。其优势在于这种结合是不可逆的，并且只能和突变的EGFR结合，而对野生型EGFR不发生作用。然而，第3代EGFR
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TKI药物仍然无法逃离靶向药物耐药的宿命，患者的无进展生存期在1年左右，部分患者产生了新的耐药突变。第3代EGFR
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TKI耐药机制复杂，奥希替尼的获得性耐药机制主要包括MET扩增、C797二次突变、Her2扩增、PIK3CA扩增、FGFR3、RET和NTRK基因融合等。C797S作为一种重要的奥希替尼耐药突变，其与T790M顺式(同一染色体)还是反式(不同染色体)突变，对于临床治疗策略有至关重要的影响。
[0005]微滴式数字PCR系统(ddPCR)在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含有带有目标基因突变的DNA片段，或者含有一个至数个带有目标基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0。根据泊松分布原理，参考阳性微滴的个数与比例即可得出所要检测的目标基因(突变)的起始拷贝数或浓度。实验结果不再依赖于Ct值，直接给出DNA的起始浓度(copies/μL)，实现真正意义上的绝对定量。实验结果判断有和无两种扩增状态不依赖于扩增效率，对PCR反应抑制物的耐受能力明显提高。反应体系微滴化可以极大的降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此特别适合在复杂背景中检测稀有突变(≥0.1％)、区分微小差异(≥1.1倍)。
[0006]相关技术中，EGFR的T790M和C797S突变及顺反式检测方法有NGS、荧光定量PCR、数字PCR方法。其中NGS方法检测灵敏度为0.2％
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1％且其检测周期长、费用高；荧光定量PCR灵敏度较低，DNA用量高，在检测突变方面不如数字PCR敏感；市场上基于数字PCR法检测EGFR
的T790M、C797S突变顺式、反式灵敏度为0.1％，但大多数无法计算突变频率。
[0007]针对上述中的相关技术，专利技术人认为，目前需要一种检测灵敏度高、检测周期短，可以准确检测出患者是否具有T790M和C797S突变及其频率，并且能定位两种突变位点的排列方式(顺式或反式)的方法。

技术实现思路

[0008]为了，本申请提供用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系。
[0009]本申请提供的用于T790M和C797S突变及顺反式检测的引物探针组合及反应体系采用如下的技术方案：
[0010]一种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式的引物探针序列，包括靶标引物探针与内参引物探针；
[0011]所述靶标引物探针序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；所述内参引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9。
[0012]本申请的目的之二在于提出一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变且可计算突变频率的方法。
[0013]本申请的上述技术目的通过以下技术方案得以实现：
[0014]一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变且可计算突变频率的方法，包括如下步骤：
[0015]步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行探针法数字PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0016]步骤二：检测微滴中扩增产物的荧光信号，由QuantaSoft完成对数据的自动处理，获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度；
[0017]步骤三：突变频率＝突变拷贝数/内参拷贝数*100％；
[0018]其中用于PCR扩增的体系中含有检测T790M，C797S双靶标突变的引物探针和内参引物探针，所述靶标引物探针的序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5其中T790M探针为HEX标记，C797S探针为FAM标记；所述内参的引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9；两条探针分别用FAM、HEX标记，使用时FAM：HEX＝1:1使扩增微滴与突变微滴区分。
[0019]可选的，所述扩增条件如下：
[0020]反应体系：2
×
ddPCRTM Supermix for Probes 10μL，DNA模板10ng，Primer Mix 2μL，去离子水至20μL；其中Primer Mix为浓度100um的靶标引物上下游1.8μL,探针1μL,以及去离子水13.4μL的混物1μL；浓度为100um的内参引物上下游1.8μL,探针1μL,以及去离子水14.4μL的混合物1μL；
[0021]反应条件：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s，40循环；98℃，10min。
[0022]本申请的目的之三在于提出一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变可判断顺反式的方法。
[0023]本申请的上述技术目的通过以下技术方案得以实现：
[0024]一种基于探针法数本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式的引物探针序列，其特征在于：包括靶标引物探针与内参引物探针；所述靶标引物探针序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；所述内参引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9。2.一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变且可计算突变频率的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行探针法数字PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测微滴中扩增产物的荧光信号，由QuantaSoft完成对数据的自动处理，获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度；步骤三：突变频率＝突变拷贝数/内参拷贝数*100％；其中用于PCR扩增的体系中含有检测T790M，C797S双靶标突变的引物探针和内参引物探针，所述靶标引物探针的序列如：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5其中T790M探针为HEX标记，C797S探针为FAM标记；所述内参的引物探针序列如：SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9；两条探针分别用FAM、HEX标记，使用时FAM：HEX＝1:1使扩增微滴与突变微滴区分。3.根据权利要求2所述的一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变且可计算突变频率的方法，其特征在于：所述扩增条件如下：反应体系：2
×
ddPCR
TM Supermix for Probes 10μL，DNA模板10ng，Primer Mix 2μL，去离子水至20μL；其中Primer Mix为浓度100um的靶标引物上下游1.8μL,探针1μL,以及去离子水13.4μL的混物1μL；浓度为100um的内参引物上下游1.8μL,探针1μL,以及去离子水14.4μL的混合物1μL；反应条件：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s，40循环；98℃，10min。4.一种基于探针法数字PCR单孔同时扩增T790M，C797S双靶标突变可判断顺反式的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行探针法数字PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙亚蒙，郭美君，徐军，邢晓娇，周建忠，
申请(专利权)人：上海柏辰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：