一种农杆菌介导白三叶愈伤组织遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导白三叶愈伤组织遗传转化方法，所述包括如下步骤：(1)建立遗传转化受体；(2)制备农杆菌工程菌液；(3)侵染与共培养；(4)抗性愈伤组织筛选培养；(5)抗性愈伤组织分化诱导；(6)抗性芽生根诱导；(7)抗性植株分子鉴定。本发明专利技术提供的农杆菌介导遗传转化再生体系操作简单易行，愈伤组织的转化率较高，为白三叶的基因工程研究和分子育种提供材料，具有科研价值、经济价值和生态价值。经济价值和生态价值。经济价值和生态价值。

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导白三叶愈伤组织遗传转化方法


[0001]本专利技术属于生物遗传转化
，具体涉及一种农杆菌介导白三叶愈伤组织遗传转化方法。

技术介绍

[0002]白三叶(Trifolium repens L.)是一种世界范围内广泛栽植的豆科草种，具有产量高、品质优良、饲用价值高、为各种牲畜所喜食等特点，同时，白三叶根部富含大量根瘤菌，固氮能力强、固氮量高，常常用于牧草补播和退化的天然草地改良。除此之外，白三叶观赏价值高、花朵饱满、覆盖地表、匍匐生长扩展能力强，也是国内外广泛种植的草坪地被植物。然而，极端温度、洪水、盐水和干旱等不利环境事件的发生率不断增加，限制了白三叶草的生产力并影响其产量。
[0003]在应用传统育种方法的同时，转基因白三叶的开发提供了一种解决限制生长或生产力的基本方法。由于白三叶的全基因组已经获得，有效利用基因组信息将有助于功能基因组学研究。同时，识别在抗逆调控机制中有前景的功能基因具有重要意义。但是，目前在开发适用于白三叶的有效遗传转化系统方面进展甚微。筛选合适的外植体以及适当遗传转化程序，来进行白三叶遗传转化是亟待解决的问题。
[0004]非专利文献谷俊涛等."农杆菌介导白三叶草高效遗传转化和转基因植株再生."草业学报16.2(2007):6.公开了一种以子叶下胚轴为外植体，通过农杆菌Ti质粒介导建立的白三叶遗传转化方法。
[0005]非专利文献王丹等."利用农杆菌浸种法建立白三叶草遗传转化体系的研究."中国农业科技导报1(2009):6.公开了一种以白三叶萌动种子作为转化受体，建立的农杆菌浸种途径介导的白三叶遗传转化体系。

技术实现思路

[0006]在上述背景基础上，本专利技术提供了一种农杆菌介导白三叶愈伤组织遗传转化方法，以幼苗根系为外植体材料诱导愈伤组织，再以农杆菌侵染愈伤组织的途径进行遗传转化。所述农杆菌介导遗传转化再生体系具有方法简单、易操作等特点，为基因工程技术在白三叶中的应用提供有力支撑。
[0007]本专利技术的目的通过如下技术方案实现。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种农杆菌介导白三叶愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化方法包括如下步骤：
[0009](1)建立遗传转化受体
[0010]取3
‑
4天的白三叶幼苗的根、子叶、下胚轴、叶片或者叶柄作为外植体，于愈伤诱导培养基中诱导培养，获得胚性愈伤组织；
[0011](2)制备农杆菌工程菌液
[0012]将带有TrCML6质粒的农杆菌在LB固体培养基上划线活化至OD
600
值为0.4
‑
0.5之
间，并重悬于侵染液中用于侵染；
[0013](3)侵染与共培养
[0014]将步骤(1)获得的胚性愈伤组织置于侵染液中，低转速侵染25
‑
30min，再将侵染的愈伤组织放于共培养基中，黑暗条件下，23
‑
25℃与农杆菌共培养3
‑
4天；
[0015](4)抗性愈伤组织筛选培养
[0016]将共培养后的愈伤组织洗干净，放置于抗性愈伤筛选培养基中，黑暗条件下继续诱导抗性愈伤组织14
‑
16天；
[0017](5)抗性愈伤组织分化诱导
[0018]将步骤(4)诱导的抗性愈伤组织转移至分化筛选培养基中，在23
‑
25℃、16h光照/8h黑暗、光强4000lx环境下诱导抗性芽生成；
[0019](6)抗性芽生根诱导
[0020]将步骤(5)诱导获得的抗性芽切下，转移至生根筛选培养基中，诱导生成白三叶根系；
[0021](7)抗性植株分子鉴定
[0022]将步骤(6)中生根且叶片长势良好的白三叶幼苗移栽至土壤中，并通过PCR方法验证转化是否成功。
[0023]优选的，所述步骤(1)中的诱导培养条件为：黑暗条件，温度23
‑
25℃，每2周继代一次，培养5
‑
6周。
[0024]在本专利技术的具体实施方式中，步骤(1)中所述的根、子叶和下胚轴外植体取自发芽4天白三叶幼苗，具体操作为：将根系和下胚轴横切成2
‑
3cm的片段；将子叶沿子叶中线进行分离，将每片子叶继续切割成2
‑
3瓣。
[0025]所述的叶片和叶柄外植体取自30日龄的白三叶无菌苗，具体操作为：将叶柄切成3
‑
4mm的柄段，白三叶叶片的单个叶子剪成3
‑
4部分。
[0026]在本专利技术的最优选实施方式中，所述外植体选自白三叶幼苗的根。
[0027]步骤(2)中所述的带有TrCML6质粒的农杆菌通过如下方法得到：
[0028]a：将TrCML6基因重组到质粒载体骨架上，筛选、鉴定，获得过表达重组质粒载体；
[0029]b：采用冻融法转化过表达重组质粒载体至农杆菌，得到带有TrCML6质粒的农杆菌。
[0030]在本专利技术的具体实施例中，所述农杆菌菌株为EHA105，具有利福平抗性；质粒载体为pBI121，其T
‑
DNA区携带有GUS基因和卡那霉素抗性npt
‑Ⅱ
基因。
[0031]本专利技术所述的TrCML6基因是白三叶钙调素类似蛋白TrCML6基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0032]SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具体为：
[0033]ATGGGATAAACACAAAAACACAGCACATTTCACATTTCCTCAAAACAAAACAAACCAAACAACATCATGTGTCCTTCTGGCAGAACCCTCCGTCCACAACCTCCCACAACCGATTTCCGACCGGCATTCGACATTCTCGACACCGATTGCGACGGCAAAATAAGCCGAGACGATCTCCGTTCATTCTACGCAACCACCAGCGGCGAAGGCGTCTCTGCCGACGCAATCGGTGCCATGATGTCGGTTGCGGACACAAACATGGACGGATTTGTGGAATACGAGGAATTCGAGCGTGTTGTTAGTGGAAACAATGAAAAGAAACCGTTAGGATGTGGAGCCATGGAAGATGTGTTCAAGGTGATGGATAGAGATGGTGATGGTAAACTTAGTCATGAAGATTTGAAGAATTATATGAATTGGGCTGGTTTTGCTGCAACAGATGAAGAGA
TAAATGCTATGATTAAGCTTGGTGGTGGTGATCAAAACGGTGGCGTTAGCTTCGATGGTTTGATTCGTATATTAGCTCTTGATCATTTCGTCCCTGTTTATTGATTCATTAA ATTAATGATGATATATTATTATCT
[0034]本专利技术所述的TrCML6基因，是在前期实验的基础上通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导白三叶愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化方法包括如下步骤：(1)建立遗传转化受体取3
‑
4天的白三叶幼苗的根、子叶、下胚轴、叶片或者叶柄作为外植体，于愈伤诱导培养基中诱导培养，获得胚性愈伤组织；(2)制备农杆菌工程菌液将带有TrCML6质粒的农杆菌在LB固体培养基上划线活化至OD
600
值为0.4
‑
0.5之间，并重悬于侵染液中用于侵染；(3)侵染与共培养将步骤(1)获得的胚性愈伤组织置于侵染液中，低转速侵染25
‑
30min，再将侵染的愈伤组织放于共培养基中，黑暗条件下，23
‑
25℃与农杆菌共培养3
‑
4天；(4)抗性愈伤组织筛选培养将共培养后的愈伤组织洗干净，放置于抗性愈伤筛选培养基中，黑暗条件下继续诱导抗性愈伤组织14
‑
16天；(5)抗性愈伤组织分化诱导将步骤(4)诱导的抗性愈伤组织转移至分化筛选培养基中，在23
‑
25℃、16h光照/8h黑暗、光强4000lx环境下诱导抗性芽生成；(6)抗性芽生根诱导将步骤(5)诱导获得的抗性芽切下，转移至生根筛选培养基中，诱导生成白三叶根系；(7)抗性植株分子鉴定将步骤(6)中生根且叶片长势良好的白三叶幼苗移栽至土壤中，并通过PCR方法验证转化是否成功。2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(1)中的诱导培养条件为：黑暗条件，温度23
‑
25℃，每2周继代一次，培养5
‑
6周。3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的根、子叶和下胚轴外植体取自发芽4天白三叶幼苗，具体是将根系和下胚轴横切成2
‑
3cm的片段；将子叶沿子叶中线进行分离，将每片子叶继续切割成2
‑
3瓣；所述的叶片和叶柄外植体取自30日龄的白三叶无菌苗，具体是将叶柄切成3
‑
4mm的柄段，白三叶叶片的单个叶子剪成3
‑
4部分。4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述外植体选自白三叶幼苗的根。5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中所述的带有TrCML6质粒的农杆菌通过如下方法得到：a：将TrCML6基因重组到质粒载体骨架上，筛选、鉴定，获得过表达重组质粒载体；b：采用冻融法转化过表达重组质粒载体至农杆菌，得到带有TrCML6质粒的农杆菌。6.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌菌株为EHA105，具有利福平抗性；质粒载体为pBI121，其T
‑
DNA区携带有GUS基因和卡那霉素抗性npt
‑Ⅱ
基因。7.根据权利要求5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述的TrCML6基因是白三叶钙调素类似蛋白TrCML6基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。8.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，各阶段培养基制备方法如下：
所述步骤(1)中的愈伤诱导培养基配制方法：MS培养基加入30g/L蔗糖和200mg/L葡萄糖酸钙，加入6
‑
BA至终浓度0.5mg/L，加入2,4
‑
D至终浓度2mg/L，调节pH值至5.8，加入8g/L琼脂，在121℃下高压灭菌15min，加入VC至终浓度10μg/L；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭燕，贾彤，程碧真，吴星，唐韬，李州，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：