一种果胶裂解酶及其制备方法、以及其在制备优良性能天然纤维的应用技术

本发明专利技术提供了一种果胶裂解酶及其制备方法，以及其在制备优良性能天然纤维的应用，该果胶裂解酶的制备方法为：将基因工程菌株pEASY

【技术实现步骤摘要】
一种果胶裂解酶及其制备方法、以及其在制备优良性能天然纤维的应用


[0001]本专利技术涉及天然纤维制备
，更具体地，涉及一种果胶裂解酶及其制备方法，以及其在制备优良性能天然纤维的应用。

技术介绍

[0002]果胶酶是指能分解果胶质的一类酶的总称。根据底物及作用方式，果胶酶分为原果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、果胶裂解酶。
[0003]草本纤维生物提取有菌法和酶法，其本质均是酶催化胶质的降解。果胶酶是草本纤维原料非纤维素降解的引发因子，其催化能力是草本纤维提取的限速步骤。《苎麻生物脱胶技术规范》(NY/T 1537
‑
2007)明确了用于苎麻生物脱胶的菌株需同时分泌包括果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等非纤维素物质降解酶在内的关键性复合酶系。果胶酶作为草本纤维提取的“引发酶”被认为是最关键的因子，通常将果胶酶的酶活高低作为纤维提取酶制剂优劣的一个重要指标。果胶酶降解草本纤维原料起“黏合”作用的果胶质，使细胞结构松散，促进半纤维素酶类和其他脱胶因子的有效渗透，从而提高原料中非纤维素物质的降解效率。
[0004]目前，菌法提取获得广泛的应用。专利202010749926.6中使用黑曲霉Aspergillus niger HYA4对菠萝叶纤维进行处理，去除绝大部分木质素和半纤维素等物质；专利202110211453.9以枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、酵母菌中的至少一种经二次富集驯化得到脱胶菌种并用于罗布麻皮脱胶；专利201910749553.X和201510080723.1中分别以胡萝卜软腐果胶杆菌HG
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49或芽孢杆菌HG224和拷打相互交替对苎麻进行脱胶；专利201510080723.1中通过卷枝毛霉菌DK1与双氧水联合对亚麻、苎麻、黄麻、红麻或竹的原茎、纤维、纱线或织物进行脱胶处理制备麻纤维。这些微生物菌法提取获得了一定成效，但还存在天然微生物生长周期长、酶活力不高、所产纤维素酶损伤纤维等不足之处。
[0005]生物酶法是用酶制剂直接浸渍原料进行纤维提取。酶活性具有选择性和专一性，能准确分解和去除纤维中的非纤维素物质，具有较好的可操作性。那金等(2018)用Bacillus cereus HDYM
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02产生果胶裂解酶和果胶酸裂解酶，高效去除了亚麻胶质组分；胡佳丹等(2018)用Ralstonia sp.ZLXH
‑
4产果胶酶对香蕉假茎废弃物进行纤维提取，有效去除大部分胶质，提高了纤维素含量和性能。
[0006]随着分子生物学技术的发展，从草本纤维提取高效菌种DCE
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01中克隆出果胶酶基因，构建基因工程菌株，用于发酵生产特定的果胶裂解酶具有重要的实际生产意义。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种果胶裂解酶的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0008]将基因工程菌接种至含Amp120～150μg/mL的改良LB发酵培养液中扩培发酵，虽有
添加IPTG诱导产果胶裂解酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集酶液，即得；
[0009]其中，所述改良LB发酵培养液的质量比配方为：胰蛋白胨0.7～1.0％+酵母提取物0.4～0.6％+NaCl0.5～1.0％，余量为水；
[0010]所述基因工程菌为基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
RP65/BL21或基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
5P8/BL21；
[0011]当所述基因工程菌为基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
RP65/BL21时，收集分子量为10～50kD的酶液；当所述基因工程菌为基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
5P8/BL21时，收集分子量为50～100kD的酶液，得到所述果胶裂解酶。
[0012]在一些实施方式中，所述IPTG的添加时间为扩培发酵至OD
600
为0.4
‑
0.6；和/或，所述IPTG的添加量为控制其终浓度为1.0
‑
1.2mmol/L。
[0013]在一些实施方式中，所述蛋白酶抑制剂的添加时间为，添加所述IPTG后，在25
‑
28℃下诱导培养20
‑
22h，获得成熟发酵液。优选地，所述成熟发酵液中的果胶酶PelL活力大于1000U/mL。
[0014]在一些实施方式中，所述蛋白酶抑制剂为APMSF和DTT的混合物，所述APMSF和DTT的添加量为控制其终浓度分别为0.8
‑
1mmol/L。
[0015]在一些实施方式中，所述扩培发酵的方法具体为：
[0016]按体积比为2
‑
5：100的比例将所述pEASY
‑
E1
‑
RP65/BL21的种子液与所述改良LB发酵培养液置于密封的发酵罐中，控制灌装量为发酵罐容积的40
‑
60％，同时通过添加NH3·
H2O控制pH值为7.0
‑
7.5，调节发酵罐温度和搅拌速度分别为37℃和220r/min，对应于每升种子液的通气量为0.4
‑
0.6m3/h。
[0017]在一些实施方式中，在用于扩培发酵前，所述改良LB发酵培养液用NH3·
H2O调pH值为7.5，并在121℃下灭菌30min，冷却后添加无菌氨苄青霉素(Amp)至终浓度为120
‑
150μg/mL。
[0018]本专利技术的目的之二在于提供上述任一实施方式所述的果胶裂解酶的制备方法制成的果胶裂解酶。
[0019]本专利技术的目的之三在于提供上述的果胶裂解酶在制备优良性能天然纤维的应用。
[0020]在一些实施方式中，所述果胶裂解酶在制备优良性能天然纤维的应用包括以下步骤：
[0021]向所述果胶裂解酶中加入木聚糖酶、甘露聚糖酶和漆酶，制成混合酶制剂，所述混合酶制剂中，所述果胶裂解酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和漆酶的体积比为3～4.5：2～3：1～2：1；所述果胶裂解酶活力≥2000u/mL，木聚糖酶活力≥1000u/mL，甘露聚糖酶活力≥1000u/mL，漆酶活力≥2000u/mL；
[0022]将所述混合酶制剂按3
‑
8％(v/v)添加到草本纤维提取溶液体系中，在40～60℃、pH为7.5～9.0条件下酶解，得到天然纤维。
[0023]在一些实施方式中，还包括：
[0024]酶解后，固液分离天然纤维和酶液，天然纤维通过升温灭活残留在表面的酶，终止酶解反应；高压水枪冲洗纤维表面的残胶等，烘干后给油即得纯净的天然纤维。
[0025]本专利技术的目的之四在于提供上述任一应用方法得到的天然纤维。
[0026]相较于现有技术，本专利技术的有益效果如下：
[0027]本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种果胶裂解酶在制备优良性能天然纤维的应用，其特征在于，所述果胶裂解酶的制备方法包括以下步骤：将基因工程菌接种至含Amp120～150μg/mL的改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶裂解酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集酶液，即得；其中，所述改良LB发酵培养液的质量比配方为：胰蛋白胨0.7～1.0％+酵母提取物0.4～0.6％+NaCl 0.5～1.0％，余量为水；所述基因工程菌为基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
RP65/BL21或基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
5P8/BL21；当所述基因工程菌为基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
RP65/BL21时，收集分子量为10～50kD的酶液；当所述基因工程菌为基因工程菌株pEASY
‑
E1
‑
5P8/BL21时，收集分子量为50～100kD的酶液。2.根据权利要求1所述的果胶裂解酶在制备优良性能天然纤维的应用，其特征在于，包括以下步骤：向所述果胶裂解酶中加入木聚糖酶、甘露聚糖酶和漆酶，制成混合酶制剂，所述混合酶制剂中，所述果胶裂解酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和漆酶的体积比为3～4.5：2～3：1～2：1；所述果胶裂解酶活力≥2000u/mL，木聚糖酶活力≥1000u/mL，甘露聚糖酶活力≥1000u/mL，漆酶活力≥2000u/mL；将所述混合酶制剂按3
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8％添加到草本纤维提取溶液体系中，在40～60℃和pH为7.5～9.0条件下酶解，得到天然纤维。3.根据权利要求1或2所述的果胶裂解酶在制备优良性能天然纤维的应用，其特征在于，所述IPTG的添加时间为扩培发酵至OD
600
为0.4～0.6；和/或，所述IPTG的添加量为控制其终浓度为1.0～1.2mmol/L。4.根据权利要求1或2所述的果胶裂解酶在制备优良性能天然纤维的应用，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂的添加时间为：添加所述IPTG后，在25～28℃下诱导培养20～22h，获得成熟发酵液。5.根据权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：成莉凤，段盛文，冯湘沅，杨琦，郑科，彭正红，
申请(专利权)人：中国农业科学院麻类研究所，
类型：发明
国别省市：