禽流感病毒检测引物探针组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了禽流感病毒检测引物探针组及试剂盒，引物探针组包括H5、H7、H9亚型和通用型检测引物和探针。该检测引物和探针是针对禽流感病毒H5、H7、H9亚型和通用型高度保守且各型间存在较大差异的基因分别设计，可采用单管一步法四重实时荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
禽流感病毒检测引物探针组及试剂盒


[0001]本专利技术涉及禽流感检测
，具体涉及一种适用于一步法多重荧光定量PCR的禽流感病毒检测引物探针组及试剂盒。

技术介绍

[0002]禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)属于正黏病毒科、流感病毒属的RNA病毒，可引起禽类从呼吸系统感染到严重全身败血症等多种症状；鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽均可感染，发病情况差别较大，有的出现急性死亡，有的无症状带毒。禽流感病毒屡次暴发不仅给养殖业带来巨大的损失，同时某些禽流感病毒亚型也严重威胁着人类健康。家禽中流行的主要有H5、H6、H7、H9等亚型。H5和H7亚型的某些毒株可以造成禽类很高的发病率和死亡率，被称为高致病性禽流感(HPAI)病毒。OIE将高致病性禽流感列为A类动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。H9亚型禽流感并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型的禽流感病毒。
[0003]我国是一个人口大国，高致病性禽流感严重威胁了国民经济和人民健康，因此大力发展快速、灵敏的禽流感病毒检测方法，对我国及全球防控禽流感的传播具有重要意义。目前对于禽流感的诊断主要包括对病毒抗原、流感特异性血清的检测和分子生物学检测。病毒分离及鉴定常用方法是鸡胚培养分离法；血清学检测包括血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等可对病毒抗体进行亚型鉴定。病毒分离及鉴定耗时费力，不利于快速检测；HI和NI灵敏度低，而且操作过程复杂；ELISA特异性和稳定性好，但重复性差会受到自身抗体干扰，影响检测结果。分子技术诊断方法具有高特异性、高敏感性、快速省时等优点，主要包括普通PCR、荧光PCR等，普通PCR与荧光PCR相比检测步骤冗长，可能会出现交叉污染，而且不能准确定量。目前较多的禽流感病毒荧光PCR检测方法仅包括甲型通用和H5、H7、H9的单重荧光RT
‑
PCR方法，可检测禽流感通用病毒并同时进行H5、H7、H9亚型分型的荧光PCR方法未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种适用于一步法多重荧光定量PCR的禽流感病毒检测引物探针组及试剂盒，具有灵敏度高，特异性、重复性好，检测省时省力的优点。
[0005]本专利技术技术方案详述如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供了禽流感病毒检测引物探针组，包括H5、H7、H9亚型和通用型检测引物和探针，检测探针的5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记淬灭基团，同一检测体系中不同检测探针标记的荧光基团不同。各组检测引物和探针是针对禽流感病毒H5、H7、H9亚型和通用型高度保守且各型间存在较大差异的基因分别设计，特异性非常高；通过标记不同荧光基团，可以采用单管一步法四重实时荧光定量RT
‑
PCR，实现单管内一次反应同时检测出
禽流感病毒H5、H7、H9亚型和通用型，不仅极大的节省了试剂耗材，缩短了检测时间，并且依然具有极高的特异性和灵敏性。
[0007]可选或优选的，上述引物探针组中，所述检测探针5
’
端标记的荧光基团如下所示：
[0008]通用型检测探针：ROX，
[0009]H5亚型检测探针：FAM，
[0010]H7亚型检测探针：HEX，
[0011]H9亚型检测探针：Cy5。
[0012]第二方面，本专利技术提供了禽流感病毒检测试剂盒，其包括以上任一所述的检测引物探针组。
[0013]可选或优选的，上述试剂盒中，还包括PCR反应液和酶混合液，所述PCR反应液包括一步法荧光PCR缓冲液、Oligo dT Primer、Mg
2+
及dNTP。
[0014]可选或优选的，上述试剂盒中，所述酶混合液包括热启动酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。
[0015]可选或优选的，上述试剂盒中，所述检测引物探针的浓度均为10μmol/L。
[0016]可选或优选的，上述试剂盒中，所述试剂盒适用的样品为咽喉拭子、泄殖腔拭子、组织、禽胚尿囊液或细胞培养物。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0018](1)节省时间：本专利技术引物探针组及试剂盒适用于单管一步法四重实时荧光定量RT
‑
PCR，检测时间仅需1
‑
1.5个小时，相比传统检测方法及普通RT
‑
PCR检测方法，能快速对疑似病例进行病原检测，大大缩短了检测时间。
[0019](2)特异性好：本专利技术引物探针组专门针对于禽流感病毒H5、H7、H9亚型和通用型而设计，保证了特异性扩增并且可定量检测，准确度极高，极大程度地降低了假阳性的可能。采用鸡禽腺病毒、沙门氏菌、巴氏杆菌、圆环病毒、鸡毒支原体病毒、鸡马立克病毒、鸡传染性贫血病毒进行特异性检测发现，本专利技术的引物探针与其它病原体均无特异性反应。
[0020](3)灵敏性高：病原核酸量最低检测限度低至10拷贝/μL。
[0021](4)交叉污染少：反转录、PCR扩增和荧光检测于一管中进行，降低了交叉污染的风险，提高了检测结果的准确性。
[0022](5)重复性好：分别采用终浓度为103拷贝/μL禽流感病毒H5、H7、H9亚型和通用型的阳性对照品，对每一种亚型的样本做8个重复检测，结果不同浓度各自的检测CT值标准差SD值在0.2～0.5之间，变异系数CV均低于3％，具有较好的重复性。
附图说明
[0023]图1为实施例2用试剂盒检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型和通用型的灵敏度，检测浓度从左到右(1
‑
8)依次为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL；
[0024]图2为实施例2采用试剂盒检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型和通用型重复性扩增曲线；
[0025]图3为实施例2采用试剂盒检测其他病原体的扩增曲线图，图中1
‑
7为不同颜色，其中1鸡禽腺病毒、2沙门氏菌、3巴氏杆菌、4圆环病毒、5鸡毒支原体病毒、6鸡马立克病毒、7鸡传染性贫血病毒样品。
具体实施方式
[0026]下面结合较佳的实施例和附图对本专利技术技术方案进行详细解释和说明，本专利技术所用到的化学药品或试剂，可以根据其功能选用已有的其它类型的产品，而不仅限于实施例的具体记载。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0027]实施例1禽流感病毒检测试剂盒构建
[0028]根据Genebank库中已发表的禽流感病毒血凝素(HA)基因高度保守序列设计能够检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型和禽流感通用型多重荧光PCR简并引物和探针组合，其核苷酸序列如下：
[0029本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.禽流感病毒检测引物探针组，其特征在于，包括H5、H7、H9亚型和通用型检测引物和探针，其核苷酸序列如下所示：通用型检测引物：SEQ ID NO:1～2，通用型检测探针：SEQ ID NO:3；H5亚型检测引物：SEQ ID NO:4～5，H5亚型检测探针：SEQ ID NO:6；H7亚型检测引物：SEQ ID NO:7～8，H7亚型检测探针：SEQ ID NO:9；H9亚型检测引物：SEQ ID NO:10～11，H9亚型检测探针：SEQ ID NO:12；所述检测探针的5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记淬灭基团，同一检测体系中不同检测探针标记的荧光基团不同。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述检测探针5
’
端...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永伟，苗昱，李焕明，马广斌，王方山，王学娟，邢杰，梁雨欣，宋红彬，宋美莹，宋金栋，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：