本申请公开了一种类野山参组合物及其制备方法，以及在抗肿瘤、提升免疫力和抗衰老中的应用。该组合物实现了普通人参的活性成分进行分子重构，获得了类似于野山参甚至含量高于野山参的皂苷类成分，以及十几种类似于野山参相关蛋白片段的活性肽。与天然野山参在有效成分的丰富性、以及各种成分的构成比例上高度接近于野山参，从而实现类似于野山参的综合疗效。该组合物见效快、毒副作用小，可长期服用，是一种安全、高效、稳定、制备工艺简单的药物和保健食品，适于工业化生产，易于推广。本申请为提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老的耐药性、减轻放化疗毒副反应、抗疲劳、抗抑郁的药品和食品提供了一种新的原料与生产工艺。了一种新的原料与生产工艺。了一种新的原料与生产工艺。
【技术实现步骤摘要】
一种类野山参组合物、制备方法及在抗肿瘤、提升免疫力和抗衰老中的应用
[0001]本申请涉及野山参
，具体涉及类野山参组合物、制备方法及在抗肿瘤、提升免疫力和抗衰老中的应用。
技术介绍
[0002]《中国药典》(2000年版)中定义人参野生者为山参。野生人参(original ecological ginseng)是指在野生山林中自然分布、繁殖、生长的人参，即在原生态环境下生长，没有任何人为干预的山参。其种子通常是通过森林中的鸟类或松鼠自然传播上。野生人参是传统意义上的野山参。
[0003]野山参的药理活性远远优于园参，而野山参作为野生人参药用资源的替代品之一，其主要包含皂苷、挥发油、糖、黄酮、甾醇、氨基酸和蛋白质以及微量元素等成分。野山参对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化系统、血液及造血系统、生殖系统、内分泌系统及免疫系统均有药理作用。现代研究发现，野山参具有降低氧化应激反应、抗炎、抑制肿瘤细胞生长、缓解疲劳、降压等作用。
[0004]然而，通过经典的天然药物化学手段对野山参的化学成分进行分离和纯化，虽然也能得到这些活性成分，但是经典的化学手段的活性成分含量低、收率低，导致回收成本增加；并且往往在分离和纯化过程中，这些活性成分稳定性不佳，难以为大规模制备创造条件。
技术实现思路
[0005]本申请专利技术人创造性地发现，通过人参科恩氏菌、耐热科恩氏菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌其中的至少两种作为菌种，以含有野山参作为培养物，能够得到具有提升免疫力和抗肿瘤的类野山参组合物。如此，能够一定程度上缓解现有技术之不足。
[0006]第一方面，本申请实施例公开了一种类野山参组合物的制备方法，其包括：
[0007]利用人参科恩氏菌、耐热科恩氏菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌其中的至少两种作为菌种，以含有野山参作为培养物，制得发酵液；
[0008]收集所述发酵液，经过去菌、甲醇回流提取，得到第一上清液；
[0009]将所述第一上清液经过蛋白提取和硫酸铵沉淀处理得到第二上清液和第二沉淀物；
[0010]将所述第二上清液经过酶解、除盐和凝胶色谱纯化处理，得到第三沉淀物；
[0011]将所述第二沉淀物和所述第三沉淀物混合，冷冻干燥后即可得到所述类野山参组合物。
[0012]在本申请实施例中，所述制得发酵液的步骤具体包括：
[0013]分别制得人参科恩氏菌的种子液、耐热科恩氏菌的种子液、青春双歧杆菌的种子液和嗜酸乳杆菌的种子液；
[0014]将所述人参科恩氏菌的种子液、所述耐热科恩氏菌的种子液、所述青春双歧杆菌的种子液和所述嗜酸乳杆菌的种子液中的至少两种混合后，接种至发酵培养基中，于35℃、80rpm恒温发酵5d，即得发酵培养液。
[0015]在本申请实施例中，制得所述种子液的过程中使用了种子培养基，所述种子培养基包含：1.5％野山参粉、2.5％蛋白胨、2％葡萄糖、0.25％磷酸氢二钠、0.25％磷酸二氢钾、0.32％磷酸氢二钾、0.6％乙酸钠、0.06％柠檬酸镁、0.1％吐温80和0.05％柠檬汁。
[0016]在本申请实施例中，所述发酵培养基包含12.5％(w/v)野山参粉、3.5％(w/v)蛋白胨、4.5％(w/v)葡萄糖、0.55％(w/v)磷酸氢二钠、0.55％(w/v)磷酸二氢钾、0.15％(w/v)柠檬酸铵、0.6％(w/v)乙酸钠、0.06％(w/v)硫酸镁、0.023％(w/v)硫酸锰、0.1％(v/v)吐温80、0.25％(w/v)脱氧胆酸和0.2％(w/v)维生素K1，用柠檬酸调节pH值为6。
[0017]在本申请实施例中，“得到第一上清液”的步骤具体包括：将发酵液，于8000rpm离心15min左右去掉菌体，用甲醇热回流多次每次2h，趁热抽滤，滤液减压回收浓缩至小体积，即为第一上清液。
[0018]在本申请实施例中，“得到第二上清液和第二沉淀物”的步骤具体包括：
[0019]向所述第一上清液中混入25％的BPP蛋白提取液和等体积的25％的Tris
‑
饱和酚试剂，混匀，15000g、4℃离心15min，得到上层酚相和下层的第二沉淀物；
[0020]向所述上层酚相中加入5倍体积过饱和硫酸馁
‑
甲醇溶液，
‑
20℃过夜，15000g、4℃离心5min，取沉淀，用预冷丙酮洗涤后，再次15000g、4℃离心5min，加入适量RIPA Lysis Buffer，震荡混匀后，室温精置2h，室温下20000g离心30min，取上清溶液，即为第二上清液。
[0021]在本申请实施例中，“得到第三沉淀物”的步骤具体包括：
[0022]向所述第二上清液中加入20v/v％的变性剂和2v/v％的1mg/ml的DTT，37℃恒温处理2h后，加入20m/v％的2
‑
氯乙酰胺，室温下避光反应40min后，加入7
×
缓冲Buffer用于稀释变性剂，以1:50(w/w)的酶对蛋白质比例加入1mg/mL胰蛋白酶，37℃恒温酶解24h即可得到酶解液；
[0023]使用Sep
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Pak C18除盐柱进行样品除盐，收集洗脱液，采用凝胶色谱柱对冻干品进一步纯化，收集不同馏分的洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得到的肽段冻干品即为第三沉淀物。
[0024]第二方面，本申请实施例公开了一种类野山参组合物，其中，包含皂苷类成分和肽成分，所述皂苷类成分包括三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷F5、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Ro、人参皂苷Rg5、人参皂苷F3、人参皂苷Rs1、人参皂苷Rs2和越南参皂苷R3156012
‑
92
‑
9；所述肽成分包含如SEQ ID NO.1～2所述的肽。
[0025]在本申请实施例中，所述肽成分还包含如SEQ ID NO.3～12任一所述的肽。
[0026]第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的制备方法制得的类野山参组合物、或第二方面所述的类野山参组合物在制备抗肿瘤制品和提高免疫力制品中的应用。
[0027]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
[0028]本申请利用人参科恩氏菌、耐热科恩氏菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌其中的至少两种作为菌种，对野山参进行发酵，得到了一种类野山参组合物，该组合物不仅包含大量的皂苷类成分，还包含十几种活性肽，并且包含其他大量的糖、黄酮、甾醇和挥发油成分，与天然野山参在有效成分的丰富性、以及各种成分的构成比例上高度接近于野山参，从而实
adolescentis)，B71914，明舟生物；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，B98034，明舟生物。
[0051]3、菌株的活化
[0052]一个具体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种类野山参组合物的制备方法，其包括：利用人参科恩氏菌、耐热科恩氏菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌其中的至少两种作为菌种，以含有野山参作为培养物，制得发酵液；收集所述发酵液，经过去菌、甲醇回流提取，得到第一上清液；将所述第一上清液经过蛋白提取和硫酸铵沉淀处理得到第二上清液和第二沉淀物；将所述第二上清液经过酶解、除盐和凝胶色谱纯化处理，得到第三沉淀物；将所述第二沉淀物和所述第三沉淀物混合，冷冻干燥后即可得到所述类野山参组合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述制得发酵液的步骤具体包括：分别制得人参科恩氏菌的种子液、耐热科恩氏菌的种子液、青春双歧杆菌的种子液和嗜酸乳杆菌的种子液；将所述人参科恩氏菌的种子液、所述耐热科恩氏菌的种子液、所述青春双歧杆菌的种子液和所述嗜酸乳杆菌的种子液中的至少两种混合后，接种至发酵培养基中，于35℃、80rpm恒温发酵5d，即得发酵培养液。3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，制得所述种子液的过程中使用了种子培养基，所述种子培养基包含：1.5％野山参粉、2.5％蛋白胨、2％葡萄糖、0.25％磷酸氢二钠、0.25％磷酸二氢钾、0.32％磷酸氢二钾、0.6％乙酸钠、0.06％柠檬酸镁、0.1％吐温80和0.05％柠檬汁。4.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述发酵培养基包含12.5％(w/v)野山参粉、3.5％(w/v)蛋白胨、4.5％(w/v)葡萄糖、0.55％(w/v)磷酸氢二钠、0.55％(w/v)磷酸二氢钾、0.15％(w/v)柠檬酸铵、0.6％(w/v)乙酸钠、0.06％(w/v)硫酸镁、0.023％(w/v)硫酸锰、0.1％(v/v)吐温80、0.25％(w/v)脱氧胆酸和0.2％(w/v)维生素K1，用柠檬酸调节pH值为6。5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，“得到第一上清液”的步骤具体包括：将发酵液，于8000rpm离心15min左右去掉菌体，用甲醇热回流多次每次2h，趁热抽滤，滤液减压回收浓缩至小体积，即为第一上清液。6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，“得到第二上清液和第二沉淀物”的步骤具体包括：向所述第一上清液中混入25％的BPP蛋白提取液和等体积的25％的Tris
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【专利技术属性】
技术研发人员：石磊，赵子建，吴大明，刘玲，朱爽，吴卓瑜，
申请(专利权)人：广东天葆堂健康科技产业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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