一种提取dsRNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取dsRNA的方法，主要包括粗提液的处理，正压

【技术实现步骤摘要】
一种提取dsRNA的方法


[0001]本专利技术涉及一种提取dsRNA的方法，属于生物


技术介绍

[0002]目前在农业生产中，农业害虫防治主要以化学防治手段为主。虽然化学农药的防效显著，但是会诱发害虫产生抗药性，同时导致农药残留增加，破坏农田生态系统，这些副作用均严重影响了农业生产的可持续发展和人体健康。因此，研究新型、安全、高效的、无残留的害虫防治途径是农业生产可持续发展的重要内容。
[0003]RNA干扰技术(RNA silencing)也叫基因沉默技术，是根据目标基因的序列互补设计合成dsRNA(double
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stranded RNA，dsRNA)，dsRNA会特异性的降解该基因表达的mRNA，从而抑制该基因的表达，这项技术在医药和农业领域有非常广泛的应用前景。RNA干扰技术在农业害虫的防治方面，主要是通过抑制害虫必需基因的转录和翻译，从而降低害虫的适应性或致死害虫。dsRNA可以直接喷洒到植物表面作为外源性的杀虫剂，它可以通过害虫进食或与病原菌直接接触结合进行病虫害的防治。已经有报道证实饲喂靶向的dsRNA，对蚜虫和烟草天蛾幼虫具有很好的杀灭作用。
[0004]基于RNA干扰技术的应用，未来将给农业害虫防治带来革命性的变化。dsRNA是RNA病毒复制过程的中间产物，这些dsRNA的大小对应于RNA病毒的基因组，而正常的植物或真菌组织不含有或仅产生小分子量的dsRNA，RNA病毒复制过程会产生长度与基因组RNA相似的dsRNA，某些dsRNA病毒的子代基因组也是dsRNA，并且这些dsRNA相对于ssRNA稳定得多。dsRNA分析方法是利用CF
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11纤维素能在一定的酒精浓度下特异吸附dsRNA的原理而发展起来的。dsRNA的提取方法包括生物法和化学法。如专利CN113811612A中公开的一种dsRNA合成方法：首先选择一植物基因的一核酸序列，该核酸序列编码一沉默分子，该沉默分子以一植物基因为目标，能够募集RNA依赖型RNA聚合酶(RdRp)；随后修饰该核酸序列，从而针对有害生物基因赋予沉默特异性，使植物基因的转录物与能够募集RdRp的沉默分子形成碱基互补，以产生dsRNA分子，该dsRNA分子能够沉默植物细胞中的有害生物基因。但上述生物法涉及酶催化合成，得到的dsRNA纯度低，得率低。化学方法通常为过柱层析法，一般包括如下步骤：采用具有典型症状的食用菌组织，剪碎后用液氮研磨成粉末；用STE缓冲液及酚/氯仿/异戊醇混合液抽提，低速离心；上清液用无水乙醇调至特定浓度，注入平衡过的纤维素(CF
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11)柱中，随后洗脱；洗脱液用异丙醇、乙醇沉淀后真空抽干，即为dsRNA。但以上方法操作繁琐，价格昂贵，处理量小，提取量小，无法实现规模化提取。因此，仍需寻找一种高效提取dsRNA的方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种高效提纯dsRNA的方法，主要包括粗提液的处理，正压
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钟罩式二联过滤和醇沉步骤。本专利技术步骤简便，处理量大，处理时间短，制备的dsRNA纯度在97％以上，为大量dsRNA的大规模发酵法生产制备提供了可靠方法。
[0006]本专利技术提供一种提取dsRNA的方法，包括以下步骤：
[0007](1)将生物体或组织粉碎，得到粗提液，使用缓冲液A调节粗提液pH至7
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10，离心收集上清液；其中，缓冲液A的组成为：(i)碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；
[0008](2)使用缓冲液B调节上述上清液pH至4
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7，再次离心收集上清液；其中，缓冲液B的组成为：(i)醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾，(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；
[0009](3)对步骤(2)得到的上清液进行正压过滤，过滤期间通气干燥，洗脱得到滤液，其中，填料由珍珠岩、硅藻土和纤维素混合得到，所述珍珠岩、硅藻土和纤维素均经过醇溶液浸泡；实际操作中，可先将填料原料在醇溶液中浸泡，再按一定比例混合，也可以混合后再用醇溶液浸泡，醇溶液可以增加填料原料间的极性，通过调节原料混合比例和醇浓度来控制极性，在适合不同大小的dsRNA分子的范围内，通过极性实现特异性吸附；
[0010](4)将正压过滤得到的滤液进行钟罩式过滤，收集滤液；
[0011](5)将步骤(4)中钟罩式过滤得到的滤液进行醇沉，所述醇沉为多级醇沉，具体地，向滤液中加入醇溶液至终浓度(v/v)为10％
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30％，离心收集上清，再加入醇溶液至终浓度(v/v)为50％
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80％，离心收集沉淀，得到纯化后的dsRNA。
[0012]本专利技术中，首先选择合适的缓冲体系与离心手段配合，在保持dsRNA稳定性的基础上以去除细胞碎片和大分子，随后进行正压
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钟罩式二联过滤；正压过滤中，由于dsRNA分子量和大分子基因、蛋白有明显差异，调节填料各组分的比例和醇浓度控制极性，通过极性特异性吸附，拦截大分子杂质，目标产物流穿收集；钟罩式过滤中，由于二联过滤第一步去除了大部分的杂质，液体已经不粘稠，筛选得到最适合dsRNA收集的过滤柱滤芯——纤维素滤芯，利用dsRNA分子量和大分子基因、蛋白有明显差异，通过控制柱压和进样速度，进一步拦截大分子杂质，目标产物流穿收集。最后，依次采用10％
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30％(v/v)和50％
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80％(v/v)的醇溶液洗脱，去除大部分的盐离子和小分子蛋白，得到目标dsRNA，纯度达到97％以上。
[0013]进一步地，在步骤(1)中，使用缓冲液A调节粗提液pH之前，还包括对粗提液进行水浴和超声预处理的步骤。
[0014]进一步地，在步骤(1)中，缓冲液A的组成为：(i)0.01
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0.8M碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，(ii)0.01
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0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)0.01
‑
0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；pH6.5
‑
9.5。
[0015]进一步地，在步骤(2)中，缓冲液B的组成为：(i)0.01
‑
0.95M醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾，(ii)0.01
‑
0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)0.01
‑
0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；pH3.5
‑
6.5。
[0016]进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取dsRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物体或组织粉碎，得到粗提液，使用缓冲液A调节粗提液pH至7
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10，离心收集上清液；其中，所述缓冲液A的组成为：(i)碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；(2)使用缓冲液B调节步骤(1)所得上清液pH至4
‑
7，离心收集上清液；其中，缓冲液B的组成为：(i)醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾，(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；(3)对步骤(2)所得上清液进行正压过滤，洗脱得到滤液，其中，填料由珍珠岩、硅藻土和纤维素混合得到，所述珍珠岩、硅藻土和纤维素均经过醇溶液浸泡；(4)将步骤(3)所得滤液进行钟罩式过滤，收集滤液；(5)将步骤(4)所得滤液进行醇沉，所述醇沉为向滤液中加入醇溶液至终浓度(v/v)为10％
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30％，离心收集上清，再加入醇溶液至终浓度(v/v)为50％
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80％，离心收集沉淀，得到纯化后的dsRNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液A的组成为：(i)0.01
‑
0.95M碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，(ii)0.01
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0.95M四硼酸钠、盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦斌钰，唐雪明，黄永奎，亢升明，
申请(专利权)人：硅羿科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：