一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法技术

本发明专利技术公开了一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法。所述方法包括：将样本中的细胞、PCR反应试剂、PCR引物和探针以及细胞裂解试剂封装在液滴中，其中在所述液滴中存在至少一个细胞；利用所述液滴进行PCR，将PCR反应后的液滴进行阵列排布，检测每个液滴的荧光强度，结合泊松分布公式计算样本中目标细胞的数量，并进行基因分型分析。所述方法无需进行繁琐的细胞富集步骤及单细胞分析，而是基于液滴微流控平台，将待测血液标本均匀地分入上百万个相互独立的液滴中，无需依赖标准曲线，结合泊松分布公式即可实现细胞绝对定量，且可在单个反应内实现基因分型分析，操作简单，适合广泛推广应用。适合广泛推广应用。适合广泛推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法。

技术介绍

[0002]循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是指从原发病灶上脱落下来进入血液的肿瘤细胞，它是造成肿瘤转移的关键。研究表明，外周血中CTC的数量与肿瘤进展及预后密切相关，且CTC来自病灶部位，会携带原发病灶的遗传信息，检测、分析CTC能够“无创”地监控癌症病情进展，并提前掌握病灶部位肿瘤耐药的情况，从而及时提供干预、改善预后，因而，开发高效、准确的CTC定量及分型方法具有重要的科学和现实意义。
[0003]目前，现有的CTC研究方法包括富集及检测两部分。如CN113125738A公开一种循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：1)待测血液处理：采用密度梯度离心法对待测血液进行离心，离心后体系分为四层，白细胞和循环肿瘤细胞处于自上而下的第二层，将其中所述第二层与其他层分离并取出，得到检测液；2)循环肿瘤细胞富集：使所述检测液通过富集筛选机构进行富集；3)采用细胞核染料以及荧光标记抗体对步骤2)中富集的循环肿瘤细胞进行染色；4)荧光检测。
[0004]常见的富集手段包括亲和吸附法和基于物理性质分离法，但亲和吸附法只适用于上皮来源的CTC，且无法准确捕获存在细胞异质性的CTC，因而方法普适性较差、假阴性率较高。基于物理性质分离的方法由于CTC物理性质不均一，分离效率低而分离纯度差。常见的检测手段包括免疫荧光染色、单细胞测序及核酸分析。免疫荧光染色由于荧光通道及抗体数量有限，可获取的分型信息很少。基于细胞分选的单细胞测序方法虽能获取单个细胞的表型，但操作繁琐且临床适用性低。基于核酸检测的CTC分析方法可以通过分析肿瘤特异性基因实现CTC检测及分型，但需要先裂解CTC再进行核酸分析，这样的操作会丢失核酸和CTCs之间的关联，造成现有核酸检测方法无法同时获得准确的CTC定量信息和基因分型信息。
[0005]综上所述，迫切需要一种新的CTC分析策略，能够同时实现CTC定量及基因分型，且操作简单，以满足临床CTC分析的需求。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，所述方法无需进行繁琐的细胞富集步骤及单细胞分析，而是基于液滴微流控平台，将待测血液标本均匀地分入上百万个相互独立的液滴中，无需依赖标准曲线，结合泊松分布公式即可实现细胞绝对定量，且可在单个反应内实现基因分型分析，操作简单，适合广泛推广应用。
[0007]本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，所
述方法包括：
[0009]将样本中的细胞、PCR反应试剂、PCR引物和探针以及细胞裂解试剂封装在液滴中，其中在所述液滴中存在至少一个细胞；
[0010]利用所述液滴进行PCR，将PCR反应后的液滴进行阵列排布，检测每个液滴的荧光强度，结合泊松分布公式计算样本中目标细胞的数量，并进行基因分型分析。
[0011]本专利技术中，基于液滴微流控平台，将待测血液标本均匀地分入上百万个相互独立的液滴中，并对每一个液滴中的特异性核酸标志物进行荧光PCR分析，最后根据每个液滴的荧光强度，结合泊松分布定理计算出样本中目标细胞的具体数量，并利用不同的荧光通道实现基因分型。
[0012]优选地，所述PCR引物和探针包括针对目标细胞中基因的引物和探针。
[0013]优选地，所述目标细胞包括循环肿瘤细胞或BCR
‑
ABL融合基因突变细胞。
[0014]优选地，所述循环肿瘤细胞包括宫颈癌细胞。
[0015]优选地，所述基因包括HPV16和/或HPV18。
[0016]优选地，所述探针为TaqMan探针。
[0017]优选地，所述HPV16的正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0018]优选地，所述HPV16的反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
[0019]优选地，所述HPV16的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
[0020]优选地，所述HPV18的正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
[0021]优选地，所述HPV18的反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
[0022]优选地，所述HPV18的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
[0023]SEQ ID NO.1：5
’‑
CTCTTTGGCTGCCTAGTGAG
‑3’
。
[0024]SEQ ID NO.2：5
’‑
GCGTGCAACATATTCATCCG
‑3’
。
[0025]SEQ ID NO.3：5
’‑
ROX
‑
CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA
‑
Blackhole Quencher 2
‑3’
。
[0026]SEQ ID NO.4：5
’‑
ATTCCAGCAGCTGTTTCTGA
‑3’
。
[0027]SEQ ID NO.5：5
’‑
CCTTCTGGATCAGCCATTGT
‑3’
。
[0028]SEQ ID NO.6：5
’‑
FAM
‑
TGTGTCCGTGGTGTGCATCCCAGCA
‑
Blackhole Quencher 1
‑3’
。
[0029]优选地，所述基因包括BCR
‑
ABL。
[0030]优选地，所述BCR
‑
ABL的正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
[0031]优选地，所述BCR
‑
ABL的反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
[0032]优选地，所述BCR
‑
ABL的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
[0033]SEQ ID NO.7：5
’‑
CTGGCCCAACGATGGCGA
‑3’
。
[0034]SEQ ID NO.8：5
’‑
CACTCAGACCCTGAGGCTCAA
‑3’
。
[0035]SEQ ID NO.9：5
’‑
FAM
‑
CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA
‑
Blackhole Quencher 2
‑3’
。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，其特征在于，所述方法包括：将样本中的细胞、PCR反应试剂、PCR引物和探针以及细胞裂解试剂封装在液滴中，其中在所述液滴中存在至少一个细胞；利用所述液滴进行PCR，将PCR反应后的液滴进行阵列排布，检测每个液滴的荧光强度，结合泊松分布公式计算样本中目标细胞的数量，并进行基因分型分析。2.根据权利要求1所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，其特征在于，所述PCR引物和探针包括针对目标细胞中基因的引物和探针；优选地，所述目标细胞包括循环肿瘤细胞或BCR
‑
ABL融合基因突变细胞；优选地，所述循环肿瘤细胞包括宫颈癌细胞；优选地，所述基因包括HPV16和/或HPV18；优选地，所述探针为TaqMan探针。3.根据权利要求2所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，其特征在于，所述HPV16的正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述HPV16的反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；优选地，所述HPV16的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。4.根据权利要求2所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，其特征在于，所述HPV18的正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列；优选地，所述HPV18的反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列；优选地，所述HPV18的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，其特征在于，所述封装包括将样本中的细胞、PCR反应试剂、PCR引物和探针以及细胞裂解试剂和油相注入液滴生成芯片；优选地，所述液滴生成芯片设置有腔室及与所述腔室连通的油相入口、细胞相入口、试剂相入口和油包水液滴出口；优选地，所述油相包括氟油。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法，其特征在于，所述阵列排布包括将PCR反应后的液滴注入液滴读取芯片进行阵列排布；优选地，所述液滴读取芯片设置有油包水液滴入口、液滴读取区域及废液相出口。7.根据权利要求1
‑
6任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雯雯，刘晓蕾，王纪东，许颖，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：