一株贝莱斯芽孢杆菌UB201712及其发酵液的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株贝莱斯芽孢杆菌UB201712及其发酵液的制备方法和应用，该菌株作为柑橘采后青、绿霉病原的伴生菌被分离，鉴定属于贝莱斯芽孢杆菌，故命名为贝莱斯芽孢杆菌UB201712，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15614。贝莱斯芽孢杆菌UB201712能同时抑制意大利青霉和指状青霉，起到柑橘采后防腐保鲜效果，为防治柑橘采后青、绿霉病提供了新的选择。贝莱斯芽孢杆菌UB201712是天然病原拮抗菌，以及传统食品发酵用解淀粉芽孢杆菌类群成员，因此病原不易产生抗药性，且环境相容和食品安全性好。且环境相容和食品安全性好。且环境相容和食品安全性好。

【技术实现步骤摘要】
一株贝莱斯芽孢杆菌UB201712及其发酵液的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物生防菌剂领域，尤其是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌 UB201712及其发酵液的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]柑橘和水稻分别是我国最主要果树作物和粮食作物。柑橘采后贮藏和运输过程中，外界的机械损伤和其自身新陈代谢衰老极易招致病原侵染而腐烂变质，腐烂率在20％～40％，其中意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(P. digitatum)是引起柑橘采后青、绿霉病腐烂的最主要病原，占总腐烂率的 70％～80％。水稻生产过程，由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻灾难性的病害，该病潜伏期长，发病部位多，分布广泛，危害严重。选育出的抗性品种并不能获得对高度变异的稻瘟病菌的持续抗性，仅能维持2 3 个季节，或者2年，可因环境的改变，肥、水管理等使品种丧失抑病性，甚至变抑病为感病，同时携带抗稻瘟病基因的水稻还存在所产稻米品质低下的问题。化学防治成为上述两类病害防治的一种不可缺少的手段。然而现行化学防治出现的药物残留、病原抗药性等问题，迫使某些化学杀菌剂被禁用或限制使用，生物源杀菌剂因其环境相容性好、病原难以产生抗药性等特点已逐步占领杀菌剂农药市场，成为防治作物病害的发展方向。
[0003]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)自1835年正式命名以来，其研究已有186 年的历史，分子生物学等手段应用，人们发现枯草芽孢杆菌实际上不仅是一个表型相似的群体，而且枯草芽孢杆菌的产耐热暴露和干燥芽孢、分泌抗菌肽等特性极具生防价值，因此，近年世界各国竞向开发枯草芽孢杆菌类生防产品。现已有商业化供应的产品有：基于枯草芽孢杆菌某些菌株生产的AvogreenR(南非Ocean Agriculture公司)、Bio safeR(巴西Biocontrole Farroupilha实验室)、Biosubtilin(印度Biotech international公司)、Ecoshot(日本 Kumiai化学工业)、FZB24RWG和Rhizo PlusR(德国ABiTEP GmbH公司)、 BalladR、RhapsodyR和SerenadeR(美国AgraQuest公司)、CeaseR(美国 BioWorks公司)、CompanionR(美国Growth Products公司)、KodiakR(美国 Gustafson公司)、HiStick N/TR/SubtilexR/Pro
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MixR(美国Becker Underwood 和加拿大Premier Horticulture公司)；基于短小芽孢杆菌某些菌株生产的 Ballad Plus i SonataR和Yield ShieldR(美国Bayer CropScience公司)；基于地衣芽孢杆菌某些菌株生产的EcoGuard TM(丹麦Novozymes A/S公司)、 Biofungicide(美国Novozymes Biologicals公司)；基于解淀粉芽孢杆菌某菌株生产的RhizoVitalR42和RhizoVitalR42TB(德国ABiTEP GmbH公司)。2005 年在西班牙Malaga省Velez河发现贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis CR
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502T和CR
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14b)；2016年，发现的甲基营养芽孢杆菌与贝莱斯芽孢杆菌在表现型和基因型上存在高度一致性，故将两者合并为贝莱斯芽孢杆菌。作为一种新型菌种，现今世界上利用该菌的仅有其菌发现国：西班牙的Agricaldes公司近年利用贝莱斯芽孢杆菌某菌株生产了一种用于防治灰霉病菌(Botrytis cinerea)的 Botrybel产品，然而至今未发现有用于柑橘采后青、绿霉病防治的贝莱斯芽孢杆菌产品。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一个目的在于提供一株对柑橘采后青、绿霉病原和水稻稻瘟病原等多种病原有强烈抑制作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) UB201712。
[0005]本专利技术的第二个目的在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌UB201712发酵液的制备方法。
[0006]本专利技术的第三个目的在于提供贝莱斯芽孢杆菌UB201712在抑制作物病原，特别是防治柑橘采后青、绿霉病上的应用，它能替代现有柑橘采后青、绿霉病化学药剂防治方法，并可缓解环境污染和病原抗药性的技术问题。
[0007]本专利技术的第一个目的是这样实现的：
[0008]一株贝莱斯芽孢杆菌UB201712，特征是：现保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15614，保藏地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年4月13日；
[0009]所述菌株UB201712是申请人在培养柑橘采后病原时发现一株青、绿霉病原伴生菌，显示出对柑橘采后青、绿霉病原有强烈抑制作用，该菌为杆菌、革兰氏染色阳性、内生孢子、产淀粉酶，16s rDNA基因序列分析比对属于解淀粉芽孢杆菌类群，rpoB基因序列分析比对属于贝莱斯芽孢杆菌，具有以下具体特征：
[0010]A、形态特征：菌落干燥、乳白色、圆形边缘不规则、表面褶皱、中间有环状凸起、菌落直径为2～3mm，菌体杆状、革兰氏染色为阳性、产芽孢；
[0011]B、生理生化特性：菌株能利用D
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木糖、D
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果糖、蔗糖、麦芽糖、乳酮糖、木聚糖，不能利用D
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阿拉伯糖；氧化酶、接触酶、V
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P反应为阳性，甲基红反应和柠檬酸盐利用为阴性；菌株能使淀粉水解、明胶液化，可产淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶；菌株能在10％NaCl浓度下生长，生长最低pH为4.5；
[0012]C、分子特征：对菌株DNA抽提，16s rDNA和rpoB基因扩增，分别进行序列分析并上传到NCBI，获得序列号为MN596018和MN608112，blast比对并构建系统发育树。
[0013]本专利技术的第二个目的是这样实现的：
[0014]一株贝莱斯芽孢杆菌UB201712发酵液的制备方法，特征是：按下列步骤进行：
[0015]A、挑取活化好的菌株UB201712的单菌落于15～30mL的NA(营养琼脂) 液体培养基中，置于28～37℃、160～200rpm摇床中振荡培养14～18h，取对数生长期的菌体发酵液，调节菌体发酵液OD
600
至0.8～1.2，制备得到种子液；
[0016]B、将所述步骤A中的种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，装液量为60～80mL/250mL，种子液的接种量为5～8％，在30～37℃、160～200rpm 摇床中振荡培养50～58h，制备得到所述贝莱斯芽孢杆菌UB201712发酵液。
[0017]步骤B中所述的发酵培养基包括豆粕2～6g/L、酵母浸粉3～7g/L、麸皮 4～6g/L、糖蜜4～6g/L、硫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis UB201712，其特征在于：现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15614。2.一株贝莱斯芽孢杆菌UB201712发酵液的制备方法，其特征在于：按下列步骤进行：A、挑取活化好的菌株UB201712的单菌落于15～30mL的NA液体培养基中，置于28～37℃、160～200 rpm摇床中振荡培养14～18 h，取对数生长期的菌体发酵液，调节菌体发酵液OD
600
至0.8～1.2，制备得到种子液；B、将所述步骤A中的种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，装液量为60～80mL/250mL，种子液的接种量为5～8％，在30～37℃、160～200 rpm摇床中振荡培养50～58h，制备得到所述的贝莱斯芽孢杆菌UB201712发酵液。3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌UB201712的制备方法，其特征在于：步骤B中所述的发酵培养基包括豆粕2～6 g/L、酵母浸粉3～7 g/L、麸皮4...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍光华，崔朝宇，郑先能，潘春奇，霍达，吴天福，龙昊知，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：