超小型纳米颗粒及其制备、使用和分析方法技术

本公开提供了分析和/或纯化可以用一个或多个染料基团官能化的无机纳米颗粒的方法。分析和/或纯化所述无机纳米颗粒包括利用液相色谱法，例如高效液相色谱法(HPLC)。本公开的方法可以用于确定一个或多个染料基团在所述无机纳米颗粒上和/或中的位置。本公开还提供了制备无机纳米颗粒和无机纳米颗粒的组合物的方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】超小型纳米颗粒及其制备、使用和分析方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年11月4日提交的美国临时申请第62/930,539号的优先权，所述美国临时申请的公开内容通过引用并入本文。
[0003]关于联邦政府资助的研究或开发的声明
[0004]本专利技术是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号CA199081和GM122575在政府支持下进行的。该政府在本专利技术中享有某些权利。

技术介绍

[0005]二氧化硅纳米颗粒(SNP)因其大比表面积、惰性和高生物相容性而在潜在治疗/诊断应用中引起了的关注。然而，大多数SNP的尺寸均>10nm。
[0006]纳米颗粒合成在从能源到医疗保健的许多研究领域中十分普遍，并且为获得如量子点或聚合物、金属和氧化物纳米颗粒等各种各样的材料提供了途径。成功的纳米颗粒制备方法的关键特性是批次间的再现性以及对尺寸、亮度和表面化学等性质的控制。在过去五到十年中，越来越关注超小型(直径<10nm)纳米颗粒的合成。除了在此尺度下出现的独特性质外，其小尺寸使得能够使用高效液相色谱法(HPLC)来定量地分析颗粒表面化学性质。虽然HPLC在具有精确定义的分子材料(如小分子、大分子结构(如树状物和蛋白质))的领域中十分普遍，但HPLC在无机核
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有机壳(核
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壳)纳米颗粒中的成功应用是最近的发展。由于HPLC在合成产物质量控制方面具有公认的多功能性，这为分析纳米颗粒增添了一个新颖且有趣的维度，例如进一步调整其表面化学性质以用于生物应用。在单个合成批次中，HPLC允许将纳米颗粒的表面化学性质的变化映射到色谱图中的不同峰上。此类对颗粒表面化学性质的不均匀程度的定量评估与通常例如通过ζ电位或光谱测量揭示的平均颗粒表面性质形成鲜明对比。此外，与凝胶渗透色谱法(GPC)等其它分析技术相组合，HPLC能够实现多维相关性分析。例如，在联用的GPC
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HPLC运行的情况下，这允许将表面化学不均匀性映射到粒径分散性上。这进而为回答颗粒批次不均匀性如何调节生物应答的问题打开了大门，由于缺乏适当的定量表征技术，这是迄今为止一个很大程度上尚未探索的领域。
[0007]用此种类型的分析技术进行深入研究的一个特别感兴趣的系统是Cornell'点(C'点)，这是一类超小型(直径<10nm)荧光核
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壳二氧化硅纳米颗粒，目前正在进行多个临床试验以测试诊断和治疗临床潜力[用于转移性黑色素瘤(NCT01266096，NCT03465618)和恶性脑肿瘤(NCT02106598)的靶向PET和/或光学检测]。C'点由荧光染料构成，所述荧光染料共价包封在二氧化硅核内，所述二氧化硅核通过溶胶
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凝胶化学生长并且用如聚(乙二醇)
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硅烷(PEG
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硅烷)壳等刷状物共价涂覆。包封的荧光染料可以基于应用而变化，但通常使用如Cy5和Cy5.5等染料，因为其近红外(NIR)吸收和发射曲线有利于生物应用。这些染料的基本化学结构是极度疏水性的。因此，为了增加其亲水性并促进其在水性介质中的用途，通常在染料外围引入磺酸根基团。
[0008]在基于水的C'点合成的早期迭代中，Cy5和Cy5.5染料的磺化类似物通常通过马来酰亚胺
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硫醇偶联反应与硅烷部分缀合。然后通过溶胶
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凝胶过程将所得染料
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硅烷缀合物
共价包封到二氧化硅基质中并且随后进行PEG化，从而相对于水中的游离染料，所得核
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壳点的光物理性质增强并且亲水性显著增加。然而，最近采用HPLC阐明此类C'点的表面化学性质的工作揭示，使用带负电荷的磺化Cy5是导致表面化学不均匀性显著的原因。此类颗粒的HPLC色谱图表现出多个峰(参见下图2a)。最短洗脱时间处的第一个峰对应于具有所期望的纯PEG化纳米颗粒表面的C'点，其中Cy5染料被完全包封或完全不存在。随后的峰可以分别归属于二氧化硅纳米颗粒表面上的一个、两个或三个Cy5染料，二氧化硅纳米颗粒表面上的所述染料导致PEG链之间出现疏水性区块，这进而使得在HPLC色谱中观察到向更长的洗脱时间偏移。这些结果得到了其他技术的证实，如脉冲后校正荧光相关光谱法(FCS)、单颗粒光漂白和分子动力学模拟。发现是染料电荷在将特定染料成功包封到二氧化硅基质中发挥了关键作用，而不是将其共价连接到二氧化硅纳米颗粒核表面上。
[0009]对用于产生具有所期望的特征的无机纳米颗粒的方法存在持续且未满足的需求。

技术实现思路

[0010]本公开提供了分析和/或纯化无机纳米颗粒(例如，核或核
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壳纳米颗粒)的方法。所述无机纳米颗粒在本文中也称为超小型纳米颗粒。本公开还提供了制备无机纳米颗粒和包含无机纳米颗粒的组合物的方法。
[0011]在各个实例中，本公开提供了：
[0012](1)高效液相色谱(HPLC)方法的应用，所述高效液相色谱方法能够发现无机纳米颗粒(例如，荧光核
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壳二氧化硅纳米颗粒)中迄今为止未知的表面化学不均匀性。
[0013](2)用于克服所观察到的固有纳米颗粒不均匀性的设计标准的鉴定。
[0014](3)对荧光染料电荷是控制表面化学不均匀性的关键参数的发现。
[0015](4)在一些实施例中使用如ATTO647N、MB2、所有花青基染料(例如，Cy5、Cy5.5、Cy7等)等带正电荷的染料来合成具有高度均匀的表面化学性质的C'点，所述C'点在HPLC分析中仅显示一个单峰。
[0016](5)这些均匀的C'点对化学降解表现出极高的稳定性。
[0017](6)当与先前报道的材料相比时，这些均匀的C'点表现出极高的光稳定性。
[0018]在某些实例中，本公开提供了：
[0019](1)构建具有完全均匀的表面化学性质的超小型(小于10nm)纳米颗粒。
[0020](2)降低染料对溶剂环境的敏感性，如ATTO647N等疏水性染料通常不能可靠地用于基于水的应用中。
[0021](3)用于临床相关的诊断成像的用途。
[0022](4)用于改善纳米颗粒诊断和治疗的生物分布的用途。
[0023](5)用于临床转化过程中的其它纳米颗粒的用途。
[0024](6)可用于分析直到现在还不易于表征的PEG化材料的表面化学工程。
[0025]在一方面，本公开提供了通过液相色谱法分析和/或纯化无机纳米颗粒。可以使用HPLC和/或GPC进行合成、分析和/或纯化。还提供了用于使染料完全包封在纳米颗粒中的合成途径。
[0026]包含各种染料基团的无机纳米颗粒可以适用于分析和/或纯化。所述染料基团可以位于无机纳米颗粒上和/或中(由所述无机纳米颗粒包封(完全包封)或部分包封(完全包
封)，或者包封或部分包封本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于合成包含一种或多种染料且表面用聚乙二醇(PEG)基团官能化的无机纳米颗粒的方法，所述方法包括：a)在室温下形成包含水、TMOS、碱和染料前体的反应混合物；b)i)在时间(t1)和温度(T1)下保持所述反应混合物，由此形成平均尺寸为2nm到15nm的无机纳米颗粒，或者ii)如有必要，将所述反应混合物冷却至室温，并且将壳形成单体添加到来自a)的所述反应混合物中，由此形成核尺寸为2nm到15nm和/或平均尺寸为2nm到50nm的无机纳米颗粒；c)如有必要，将包含来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒的所述反应混合物的pH调节至6到10的pH；d)在室温下向包含来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒的所述反应混合物中添加PEG
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硅烷缀合物，并且在时间(t2)和温度(T2)下保持所述所得反应混合物；e)在时间(t3)和温度(T3)下加热来自d)的所述混合物，由此形成表面用PEG基团官能化的无机纳米颗粒；以及f)通过液相色谱法将所述反应混合物纯化，其中所述染料前体、所述TMOS、所述碱和所述PEG
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硅烷的摩尔比为0.0090
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0.032:11
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46:0.5
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1.5:5
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20，并且所述方法产生所述的包含一种或多种染料且表面用聚乙二醇(PEG)基团官能化的无机纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱选自氢氧化铵、含氨的乙醇、三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾和其组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱具有某一浓度并且所述浓度为0.001mM到60mM。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括从所述反应混合物中分离多个无机纳米颗粒中的选定部分。5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过凝胶渗透色谱法(GPC)分析所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分。6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过高效液相色谱法(HPLC)分析所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括：将多个无机纳米颗粒沉积在色谱柱中，所述色谱柱包括输入端，所述输入端与固定相流体连通，所述固定相与输出端流体连通，所述输出端与检测器流体连通；使流动相通过所述色谱柱，使得所述多个无机纳米颗粒从所述柱中洗脱；以及收集包含所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分的洗脱液。8.根据权利要求6所述的方法，其包括：将所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分沉积在HPLC柱中，所述HPLC柱包括输入端，所述输入端与固定相流体连通，所述固定相与输出端流体连通，所述输出端与检测器流体连通；使流动相通过所述HPLC柱，使得所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分从所述柱中洗脱并进入所述检测器，使得所述检测器产生信号，其中所述信号指示所述一种或多种染
料在所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分中的各个无机纳米颗粒上和/或中的所述位置；分析所述信号以确定所述一种或多种染料在所述多个无机纳米颗粒中的所述选定...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：